光合細菌雙層平板計數(shù)方法的研究

1、沈陽農(nóng)業(yè)大學學報,2001-04,32(2):110-112JournalofShenyangAgriculturalUniversity,2001-04,32(2):110-112光合細菌雙層平板計數(shù)方法的研究孫軍德,趙春燕,李炳學,王(沈陽農(nóng)業(yè)大學,遼寧沈陽110161)壘,陳錫時摘要:通過大量試驗,證明雙層平板法是光合細菌測數(shù)的較好方法。它彌補了傳統(tǒng)方法的測數(shù)不準確、操作繁瑣的缺點。通過正交設(shè)計試驗,確定影響光合細菌測數(shù)的4個主要因素的最佳組合為:底層培養(yǎng)基瓊脂含量為0.8%,烤板時間為0.5h,上層培養(yǎng)基溫度為50e,上層培養(yǎng)基瓊脂含量為1.0%。關(guān)鍵詞:光合細菌;雙層平板法;計數(shù)中圖

2、分類號:Q939.1文獻標識碼:A文章編號:1000-1700(2001)02-0110-03Double-plateCountingMethodofPhotosyntheticBacteriaSUNJun-de,ZHAOChun-yan,LIBing-xue,WANGLei,CHENXi-shi(ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110161,China)Keywords:photosyntheticbacteria(PSB);double-plate;counting光合細菌在養(yǎng)殖業(yè)、種植業(yè)上的應(yīng)用日益廣泛,近幾年,出現(xiàn)了許多光合細菌制劑。為確保

3、這類菌劑的質(zhì)量,活菌計數(shù)極為重要。光合細菌是兼性厭氧菌,常規(guī)方法采用71培養(yǎng)基平板計數(shù)法計數(shù),但由于長時間光照使培養(yǎng)基表面滲水導致計數(shù)不準確,操作復雜且需要特殊的設(shè)備。因此,在原有71配方厭氧罐平板計數(shù)法基礎(chǔ)上,本研究提出了一種適合光合細菌的計數(shù)方法)雙層平板法,與原有方法相比,這一方法既簡便又準確。1#11材料與方法1.1樣品來源光合細菌(Rhodopseudomonaspalustris)B9菌液由沈陽農(nóng)業(yè)大學微生物教研室提供。光合細菌菌液(蚌埠生物制品廠產(chǎn))和固體菌粉(浙江精科生物公司產(chǎn))從商店購得。1.2培養(yǎng)基1.3菌液稀釋采用常規(guī)方法對菌液稀釋,即用移液管取10mL菌液移于盛有90m

4、L無菌水的三角瓶中,以此類推,將菌液稀釋至10,10,10。1.4操作步驟取不同稀釋度的光合細菌菌液(一般為10,10,10)0.1mL均勻涂布于光合細菌底層固體培養(yǎng)基上,置4550e下烘去水分后,加入冷卻至50e的光合細菌上層固體培養(yǎng)基15mL,置2830e,8001000lx光照下培養(yǎng)56d,測定菌落數(shù)。收稿日期:2000-09-04作者簡介:孫軍德(1963-),男,沈陽農(nóng)業(yè)大學土地與環(huán)境學院副教授,碩士,從事微生物學研究。-6-7-8-6-7-8瓊脂含量為0.8%,另加0.2%酵母膏。其余同71培養(yǎng)基。瓊脂含量為1.0%,另加0.2%酵母膏。其余同71培養(yǎng)基。#p研究報告RESEARC

5、HREPORT第2期孫軍德等:光合細菌雙層平板計數(shù)方法的研究#111#此外,半固體試管法試驗按參考文獻5,厭氧罐平板計數(shù)法試驗按參考文獻1。1.5光合細菌雙層平板法培養(yǎng)條件優(yōu)化在各因素單因子試驗的基礎(chǔ)上,選定底層培養(yǎng)基的瓊脂含量(A)、烤板時間(B)、上層培養(yǎng)基溫度(C)及上層培養(yǎng)基瓊脂含量(D)4個主要因素設(shè)計4因素3水平正交試驗,所設(shè)4個因素3個水平見表1。按正交設(shè)計試驗L9(3)表設(shè)計試驗,共進行了9組試驗,試驗組合見表3。表1各因素水平設(shè)計Table1ThelevelsoffourfactorsB(H)0.51.02.1結(jié)果與分析雙層平板計數(shù)法與其他方法比較分別采用半固體試管法、厭氧罐

6、法和本方法測定同一菌液,結(jié)果見表2。從表2結(jié)果可以看出,厭氧罐法和半固體試管法所測得的數(shù)量比雙層平板法要多,且前兩法重復間誤差較大,重現(xiàn)性不好。這是因為,厭氧罐法由于長時間光照,培養(yǎng)基滲水造成光合細菌菌落擴散,導致所測定的菌數(shù)增加,重復性差,甚至導致菌落成片而無法計數(shù);而半固體試管法雖解決了培養(yǎng)基滲水問題,但由于試管為圓柱體,計數(shù)過程中易于造成重復多次計數(shù)使所測得的數(shù)量多于實際數(shù)。本試驗確立的雙層平板法既解決了培養(yǎng)基的滲水問題,又使所測定的菌落處在同一平面上便于觀察計數(shù),從而使測定的結(jié)果較為準確。另外,前兩種方法所用儀器設(shè)備較多,操作比較復雜。表2光合細菌雙層平板計數(shù)法與其他方法比較Table

7、2Thecontrastbetweendouble-platewithothercountingmethodsofPSB厭氧罐法Anaerobicculture半固體試管法Semi-solidculture雙層平板法Double-plateculture實測平均誤差(%)實測平均誤差(%)實測平均誤差(%)RecordAverageErrorRecordAverageErrorRecordAverageError2.2光合細菌雙層平板計數(shù)方法培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果將9組試驗在同一稀釋度的菌數(shù)進行統(tǒng)計分析,結(jié)果見表3,分析值見表中的(1)、(2)、(3)行。根據(jù)各因子分析值的極差可以看出,各因素的影響

8、大小為上層培養(yǎng)基瓊脂含量(D)>底層培養(yǎng)基瓊脂含量(A)>烤板時間(B)>上層培養(yǎng)基溫度(C)。這說明上層培養(yǎng)基瓊脂含量這一因素是主要的,對計數(shù)結(jié)果影響最大;而底層培養(yǎng)基瓊脂含量為第二位因素,它與上層培養(yǎng)基瓊脂含量因素的極差相差2.1,說明這一因素也很重要,這在實際測定中已經(jīng)證明。對各因素的極差進行比較可知,4個因素相應(yīng)水平的分析值最高的分別為A(2)、B(1)、C(2)、D(1),這說明光合細菌雙層平板法最優(yōu)化的培養(yǎng)條件組合為:底層培養(yǎng)基瓊脂含量為0.8%,烤板時間為0.5h,上層培養(yǎng)基溫度為50e,上層培養(yǎng)基瓊脂含量為1.0%。p研究報告RESEARCHREPORT#11

9、2#沈陽農(nóng)業(yè)大學學報第32卷試驗Test123456789分析值(1)Analysis(2)value(3)RTable3ThetesttableoffourfactorsinthreelevelsB烤板時間C溫度D上層瓊脂含量HouroftoastTemperatureUpperagar菌數(shù)PSBnumber8-1(10#mL)Note:Thevaluesin(1),(2),(3)linesaretheanalysisvaluesofallfactorsinrelevantlevel.Ristherangeofanalysisvalues.3小結(jié)(1)光合細菌雙層平板法是一種簡便準確的計數(shù)方法,彌補了厭氧罐法和半固體試管法的缺點,結(jié)果準確且操作簡便。(2)雙層平板法的主要培養(yǎng)條件經(jīng)4因素3水平正交設(shè)計試驗,確立最優(yōu)培