青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum) 綠色熒光蛋白標(biāo)記研究

1、11期 車(chē)建美等：含綠色熒光蛋白標(biāo)記的青枯雷爾氏菌確良（Ralstonia solanacearum）青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum） 綠色熒光蛋白標(biāo)記研究車(chē)建美1,2，藍(lán)江林1，劉 波1（1福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州 350003；2福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）摘要：【目的】采用電擊法對(duì)青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）進(jìn)行g(shù)fp/luxAB基因雙標(biāo)記，研究標(biāo)記前后菌株的生長(zhǎng)差異、以及侵染性和致病性的變化?！痉椒ā客ㄟ^(guò)電擊法進(jìn)行青枯雷爾氏菌的遺傳轉(zhuǎn)化，采用番茄組培苗對(duì)標(biāo)記菌株的侵染條

2、件和侵染過(guò)程進(jìn)行初步研究?！窘Y(jié)果】成功地采用gfp/luxAB基因標(biāo)記了青枯雷爾氏菌。標(biāo)記后的菌體細(xì)胞形狀與親本菌株形狀相同，均為長(zhǎng)橢圓形，近桿狀，整個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，PCR結(jié)果表明，從標(biāo)記青枯雷爾氏菌菌株的基因組DNA中擴(kuò)增出約3.0 kb的gfp基因片段。標(biāo)記菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，熒光素酶活性快速增加，到穩(wěn)定期，熒光素酶活性降低。在無(wú)選擇壓力條件下連續(xù)移植20次，仍然保持均勻而且強(qiáng)烈的綠色熒光，熒光穩(wěn)定性保持在100%。gfp基因標(biāo)記前后的菌株在培養(yǎng)的最適溫度、最佳pH值及生長(zhǎng)曲線上基本一致，在番茄組培苗內(nèi)的侵染路線相同，致病力均達(dá)到90%以上?！窘Y(jié)論】利用gfp和luxAB融合基因成功轉(zhuǎn)入青

3、枯雷爾氏菌，融合基因在標(biāo)記菌株中的表達(dá)高效穩(wěn)定。導(dǎo)入的gfp基因?qū)λ拗鞯纳L(zhǎng)特性及致病性沒(méi)有影響。關(guān)鍵詞：青枯雷爾氏菌；電擊法；gfp/luxAB基因GFP Tagging Ralstonia solanacearum with gfp/luxAB mini-Tn5CHE Jian-mei1,2, LAN Jiang-lin1, LIU Bo1(1Agricultural Bioresource Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003; 2Key Laboratory of Biope

4、sticide and Chemical Biology, Fujian Agricultrue and Forestry University, Ministry of Education, Fuzhou 350002)Abstract: 【Objective】The Ralstonia solanacearum strain was chromosomally tagged with the marker genes gfp and luxAB by electroporation. The growth properties and the pathogenicity of the ta

5、gged strain and the wild type strain were compared in this paper.【Method】The R. solanacearum strain was transformed by the electroporation. The condition and processor of the invasion of the GFP-tagged strain was observed in the tomato tissue culture plants. 【Result】 Transformant was screened for th

6、e green fluorescence by fluorescence stereomicroscopy. A 3.0 kb fragment of the gfp gene and luxAB gene was amplified from the genome DNA of the GFP-tagged strains. Morphologically, the cells of the engineered strain were similar to wild type strain as determined by laser scanning confocal microscop

7、y. Luciferase activity of the GFP-tagged strain increased rapidly during the log phase, but decreased in the stationary phase. The green fluorescence could be kept until 20 times of subcultures. It was the same for the GFP-tagged strian and the wild type strain in the culture temperature, pH value a

8、nd growth curve. These results confirmed that the dual marker was inserted successfully into the R. solanacearum strain. The pathogenicity of the wild type strain and the GFP-tagged strain was over 90% which means gfp gene had no effect on the pathogenicity. 【Conclusion】The GFP-tagged R. solanacearu

9、mis obtained in this study. The growth propertities and the pathogenicity of the GFP-tagged strain is the same to the wild type strain.Key words: Ralstonia solanacearum; Electroporation; gfp/luxAB gene0 引言【研究意義】植物細(xì)菌性青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種毀滅性的土傳細(xì)菌病害。青枯雷爾氏菌寄主廣泛，可侵染44個(gè)科數(shù)百種植物1。植物青枯細(xì)菌致病

10、的分子機(jī)制是植物與微生物相互作用機(jī)制研究的重要領(lǐng)域之一。在植物根際土壤中和植株體內(nèi)存在著大量的青枯雷爾氏菌，這給青枯雷爾氏菌侵染致病機(jī)理的研究帶來(lái)了困難。將gfp基因轉(zhuǎn)入青枯雷爾氏菌將有助于研究青枯雷爾氏菌在活體植物體內(nèi)的侵染過(guò)程，建立菌體生物量的直觀測(cè)定方法，從而為更加深入地研究青枯雷爾氏菌致病機(jī)理及青枯病生物防治機(jī)制奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】綠色熒光蛋白（GFP）最早是從水母中分離出來(lái)的，是一種非酶性報(bào)告因子，該蛋白能夠自身催化形成發(fā)色結(jié)構(gòu)并在紫外或藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，作為報(bào)告基因，GFP是目前能在活細(xì)胞中表達(dá)的發(fā)光蛋白之一，作為熒光標(biāo)記分子，GFP既具有敏感的標(biāo)記檢測(cè)率，又沒(méi)有放射性

11、的危害2。GFP檢測(cè)方便，熒光穩(wěn)定，易于構(gòu)建載體且對(duì)活細(xì)胞無(wú)毒害，對(duì)目的基因的功能也沒(méi)有影響，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞可以繼續(xù)傳代2。利用GFP標(biāo)記進(jìn)行病原菌侵入活體細(xì)胞過(guò)程的跟蹤觀察更開(kāi)創(chuàng)了病理學(xué)研究的新時(shí)代35。Unge等6的研究證明了熒光與菌體細(xì)胞數(shù)量呈線性關(guān)系，也為通過(guò)熒光直接對(duì)細(xì)菌記數(shù)提供了一個(gè)方便快捷的方法。gfp基因在其它細(xì)菌上的轉(zhuǎn)化有過(guò)許多報(bào)道，但是，青枯雷爾氏菌gfp基因轉(zhuǎn)化非常困難，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都試圖進(jìn)行青枯雷爾氏菌gfp基因轉(zhuǎn)化，然而，成功的例子非常少，通過(guò)NCBI檢索，僅見(jiàn)兩篇關(guān)于gfp基因轉(zhuǎn)入青枯雷爾氏菌的報(bào)道7,8，一篇是采用自然轉(zhuǎn)化的方法將來(lái)自AW1-gfp38菌株的Tn5:

12、gfp轉(zhuǎn)入青枯雷爾氏菌K607，另一篇?jiǎng)t采用細(xì)胞融合的轉(zhuǎn)錄方法將hrp-gfp基因轉(zhuǎn)入GMI10008?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】未見(jiàn)關(guān)于采用電擊轉(zhuǎn)化法進(jìn)行青枯雷爾氏菌的gfp基因轉(zhuǎn)化的報(bào)道。目前在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)關(guān)于青枯雷爾氏菌gfp基因轉(zhuǎn)化的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在本研究中，作者采用帶有g(shù)fp/luxAB雙標(biāo)記基因的pUT mini-Tn5轉(zhuǎn)座載體，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法成功地將它整合到青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）染色體上，并利用熒光顯微鏡檢測(cè)GFP在標(biāo)記菌中表達(dá)后發(fā)出的綠色熒光，同時(shí)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化菌體的gfp基因檢測(cè)和轉(zhuǎn)化菌株的微生物學(xué)異質(zhì)性檢測(cè)，研究轉(zhuǎn)化菌株的生物學(xué)穩(wěn)定性，為青枯

13、雷爾氏菌gfp基因轉(zhuǎn)化和致病機(jī)理的研究提供方法。1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料1.1.1 菌株和質(zhì)粒 青枯雷爾氏菌（R. solanacearum）編號(hào)Rs91菌株為本實(shí)驗(yàn)室從番茄植株上分離純化得到并保存。大腸桿菌（Escherichia coli）CC118為轉(zhuǎn)座載體pUT gfp/luxAB的宿主菌，由瑞典農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物系Janet K. Jasson教授惠贈(zèng)，其中帶有雙標(biāo)記基因gfp/luxAB 9，質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖1。圖1 質(zhì)粒pUT gfp/lux圖譜Fig. 1 The map of pUT gfp/lux1.1.2 培養(yǎng)基、抗生素與試劑 大腸桿菌（E. coli）CC118的培養(yǎng)基為

14、LB培養(yǎng)基；青枯雷爾氏菌的培養(yǎng)基為0.1×TSB；質(zhì)粒大量提取及純化試劑盒為德國(guó)QIAGEN公司的QIAGEN Plasmid Maxiprep Kit；抗生素卡那霉素（Kanamycin，Km）購(gòu)自Sigma公司；電轉(zhuǎn)化儀為Bio-Rad Gene Pulser ；立體熒光顯微鏡（Leica MZ12）為瑞士萊卡儀器公司產(chǎn)品。凝膠成像儀BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging System、離心機(jī)為德國(guó)生產(chǎn)的Hettich mikro200R。引物gfplux Forw Not I（5'-gcggccgcataggta aaggag

15、aagaac ttttcact -3'）和引物gfplux Rev Not I（5'-gcggccgct tacgag tggtatttgacgatgtt-3'）由美國(guó)Invitrogen公司合成。1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）的gfp基因轉(zhuǎn)化1.2.1.1 質(zhì)粒的提取 參照文獻(xiàn)10。質(zhì)粒提取及純化步驟按QIAGEN質(zhì)粒大量提取試劑盒提供的方法進(jìn)行。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，上樣量為2 l。1.2.1.2 青枯雷爾氏菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 從0.1× TSB固體平板上挑取新鮮的青枯雷爾氏菌單菌落于20

16、ml 0.1×TSB液體培養(yǎng)基中，30，150 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按照1%接種比例接入500 ml 0.1×TSB液體培養(yǎng)基中，30，150 r/min振蕩培養(yǎng)，每1 h測(cè)定1次OD600。收集生長(zhǎng)中期的培養(yǎng)物于冰水浴中放置30 min后，用無(wú)菌水沖洗細(xì)胞4次，最后將細(xì)胞懸浮于1 ml無(wú)菌水中，并在70冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.1.3 青枯雷爾氏菌的電擊轉(zhuǎn)化 參照文獻(xiàn)10。電擊轉(zhuǎn)化后取200 l菌液涂布于含有50 g·ml-1卡那霉素的0.1×TSB固體培養(yǎng)基上，30培養(yǎng)。電擊轉(zhuǎn)化的參數(shù)為：電壓2.5 kV、電容25 µF、電阻400 。1.

17、2.1.4 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的熒光檢測(cè)及激光共聚焦顯微檢測(cè) 檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)11。通過(guò)觀察菌落發(fā)出的綠色熒光直接篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，命名為Rs91-GFP。1.2.2 青枯雷爾氏菌Rs91-GFP的鑒定及熒光檢測(cè) 1.2.2.1 Rs91-GFP的PCR檢測(cè) 引物gfplux Forw Not I和引物gfplux Rev Not I（由瑞典農(nóng)業(yè)大學(xué)Janet教授組內(nèi)博士生設(shè)計(jì)，該引物可擴(kuò)增gfp和lux片段的全部序列）。采用滅菌的牙簽挑取少許新鮮培養(yǎng)的單菌落加入25 l PCR反應(yīng)體系中。25 l PCR反應(yīng)體系中含有2 l 10×Buffer；1 l 2 mmolL-1dNTPs；1 l

18、10 mmolL-1引物。所用模板DNA分別為Rs91-GFP基因組DNA、Rs91基因組DNA（陰性對(duì)照）、以及質(zhì)粒DNA（陽(yáng)性對(duì)照）。PCR循環(huán)參數(shù)為：94 預(yù)變性 2 min；進(jìn)入94 10 s，60 30 s，68 8 min，共10個(gè)循環(huán)；然后進(jìn)入94 15 s，60 30 s，68 8 min，共20個(gè)循環(huán)；最后68延伸10 min。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，上樣量為3 l，最后用Bio-Rad 2000型凝膠成像儀拍攝。1.2.2.2 Rs91-GFP的熒光素酶活性檢測(cè) 按照1%的比例將過(guò)夜培養(yǎng)的Rs91-GFP培養(yǎng)液接入0.1×TSB液體培養(yǎng)基中（含有5

19、0 gml-1 Km），置30、150 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，每2 h測(cè)定1次熒光素酶活性。熒光素酶測(cè)定方法參照文獻(xiàn)9。試驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.3 Rs91-GFP的穩(wěn)定性檢測(cè) 按照1%的比例將過(guò)夜培養(yǎng)的Rs91-GFP培養(yǎng)液接入0.1×TSB液體培養(yǎng)基中，置30、150 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，每12 h移植1次，連續(xù)20次，分別于第2、8、12、16和20次，適當(dāng)稀釋涂布于0.1×TSB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計(jì)菌體數(shù)量并于熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。1.2.4 青枯雷爾氏菌Rs91-GFP菌株的生長(zhǎng)特性1.2.4.1 Rs91-GFP生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

20、按照1%的比例將新鮮培養(yǎng)的標(biāo)記前后的菌株培養(yǎng)液接入0.1×TSB液體培養(yǎng)基（含有50 g·ml-1 Km）和0.1×TSB液體培養(yǎng)基中。置30、150 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取樣，用UV-2550紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600值，試驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.4.2 培養(yǎng)溫度對(duì)Rs91-GFP生長(zhǎng)的影響 將培養(yǎng)好的Rs91-GFP接入0.1×TSB液體培養(yǎng)基（裝瓶量25 ml/250 ml），接種量為1%，分別于25、30、35、40、45、200 r/min搖床培養(yǎng)。1.2.4.3 初始pH對(duì)Rs91-GFP生長(zhǎng)的影響 先將0.1×TS

21、B液體培養(yǎng)基（裝瓶量25 mL/250 mL）的pH值調(diào)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，將培養(yǎng)好的Rs91-GFP接入液體培養(yǎng)基，接種量為1%，于30，150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)。所有生長(zhǎng)特性的測(cè)定試驗(yàn)均在培養(yǎng)3 h后測(cè)定OD600值。調(diào)零對(duì)照為0.1×TSB液體培養(yǎng)基，另一對(duì)照為Rs91。1.2.5 青枯雷爾氏菌Rs91-GFP菌株的定殖和侵染特性1.2.5.1 溫度對(duì)Rs91-GFP菌株定殖的影響 Rs91- GFP菌株于0.1×TSB液體培養(yǎng)基中，30下振蕩培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)也配制成103 cfu/ml的孢子懸浮液，備用。番茄組培苗至45片真葉長(zhǎng)出。挑

22、選長(zhǎng)勢(shì)均一的組培苗，用無(wú)菌的組培刀傷根，接入菌液，以清水處理為對(duì)照，每處理接3瓶（每瓶3株苗），分別置于19，22，25，28和31培養(yǎng)。取整株苗稱重，按比例稀釋，每個(gè)樣品選擇兩個(gè)稀釋度，吸取0.1 ml均勻涂布0.1×TSB平板上。將涂布好的平板放入30的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察平板上菌的生長(zhǎng)情況。待平板上的菌落明顯形成且易計(jì)數(shù)時(shí)，取出統(tǒng)計(jì)平板上單菌落數(shù)量。1.2.5.2 Rs91-GFP菌株在番茄組培苗體內(nèi)轉(zhuǎn)移路線的測(cè)定 Rs91-GFP菌株的培養(yǎng)同上。番茄組培苗至45片真葉長(zhǎng)出。挑選長(zhǎng)勢(shì)均一的組培苗，用傷根法接菌6瓶（每瓶3株苗），以清水處理為對(duì)照。接菌9 h后，每3 h取1瓶，取根

23、部，基部和上部莖，葉片分別稱重研磨，按比例稀釋（具體稀釋倍數(shù)視樣品而定），Rs91-GFP的培養(yǎng)方法同上。1.2.5.3 Rs91-GFP菌株對(duì)番茄組培苗致病性影 響 Rs91-GFP菌株的培養(yǎng)及番茄組培苗的接菌方法同上。將組培苗置于30培養(yǎng)，每天觀察組培苗的生長(zhǎng)狀況，統(tǒng)計(jì)組培苗的萎蔫及死亡率。2 結(jié)果與分析2.1 pUT gfp/luxAB質(zhì)粒DNA的提取通過(guò)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，得到1條條帶，質(zhì)粒DNA的分子量為10 kb左右。所提取的質(zhì)粒DNA未見(jiàn)拖尾，說(shuō)明質(zhì)粒提取效果較好，沒(méi)有雜菌污染和宿主DNA污染，因此，可以用于青枯雷爾氏菌的轉(zhuǎn)化研究（圖2）。M: Marker; P: pUT gf

24、p/lux圖2 質(zhì)粒pUT gfp/lux的電泳圖譜Fig. 2 The plasmid of pUT gfp/lux2.2 GFP標(biāo)記的青枯雷爾氏菌的獲得及轉(zhuǎn)化子的熒光檢測(cè)本研究成功地將gfp/luxAB雙標(biāo)記基因整合到青枯雷爾氏菌Rs91染色體上，得到綠色熒光蛋白基因標(biāo)記的青枯雷爾氏菌Rs91-GFP，將轉(zhuǎn)化后的菌落置于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)菌落發(fā)綠色熒光，菌落與出發(fā)菌株形狀相同，為近圓形菌落；在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化后菌株的細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記后菌株的細(xì)胞形狀與親本菌株形狀相同，均為長(zhǎng)橢圓形，近桿狀，整個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，說(shuō)明已經(jīng)將gfp基因轉(zhuǎn)入青枯雷爾氏菌（圖3和圖4）。圖3 GFP標(biāo)記菌

25、株Rs91-GFP發(fā)光菌體Fig. 3 The cells of GFP-tagged Ralstonia solanacearum strain Rs91-GFP圖4 青枯雷爾氏菌Rs91的菌體形態(tài)Fig. 4 The cell of Ralstonia solanacearum strain Rs912.3 青枯雷爾氏菌Rs91-GFP菌株的鑒定及熒光檢測(cè)2.3.1 GFP標(biāo)記菌株的PCR鑒定 從含gfp基因的質(zhì)粒DNA和青枯雷爾氏菌Rs91-GFP基因組DNA上均擴(kuò)增出大小約為3.0 kb的片段，與預(yù)期的片段大小一致，而Rs91基因組DNA中擴(kuò)增不到目的片段，說(shuō)明gfp基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入青

26、枯雷爾氏菌（圖5）。M：Marker；1：質(zhì)粒；26：5個(gè)GFP標(biāo)記的青枯雷爾氏菌Rs91-GFP菌落；7：青枯雷爾氏菌Rs91M: Marker; 1-6: 5 colonies of Rs91-GFP; 7: Negative control圖5 PCR檢測(cè)GFP標(biāo)記青枯雷爾氏菌菌株Rs91-GFPFig. 5 PCR amplified the GFP fragment of the GFP-tagged Ralstonia solanacearum strain Rs91-GFP2.3.2 Rs91-GFP熒光素酶活性的檢測(cè) 試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，在Rs91-GFP生長(zhǎng)的過(guò)程中，熒光素酶

27、活性先呈線性增長(zhǎng)，到達(dá)穩(wěn)定期之后熒光素酶活性迅速下降。在初始培養(yǎng)的2 h，Rs91-GFP的熒光素酶活性為6.33 quanta·s-1·ml-1，隨著Rs91-GFP生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，熒光素酶活性也呈線性增長(zhǎng)，由6.33 quanta·s-1·ml-1升為7.24 quanta·s-1·ml-1，當(dāng)Rs91-GFP生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)，熒光素酶活性達(dá)到最大值，即7.38 quanta·s-1·ml-1；到了穩(wěn)定期，即培養(yǎng)的12 h之后，由于代謝能力下降導(dǎo)致熒光素酶活性逐漸降低，由對(duì)數(shù)期的7.38 quanta·

28、;s-1·ml-1降為培養(yǎng)48 h后的6.04 quanta·s-1·ml-1。對(duì)照Rs91菌株在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程熒光素酶活性都低于100 quanta·s-1·ml-1，處于試驗(yàn)儀器要求的背景熒光強(qiáng)度允許的范圍之內(nèi)。2.4 青枯雷爾氏菌Rs91-GFP的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果表明每隔12 h連續(xù)移植20次后，菌體數(shù)量變化差異不明顯，在繼代培養(yǎng)2次時(shí)，菌體數(shù)量為190×106個(gè)/ml，在移植培養(yǎng)8次后，菌體數(shù)量為181×106個(gè)/ml，移植培養(yǎng)16次時(shí)，菌體數(shù)量178×106個(gè)/ml，移植培養(yǎng)20次后，菌體數(shù)量達(dá)到209

29、15;106個(gè)/ml。將不同移植時(shí)間的菌液涂布于平板上培養(yǎng)觀察綠色熒光表達(dá)的情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)在移植培養(yǎng)2次，8次甚至20次后，所有菌落均保持著均勻并且強(qiáng)烈的綠色熒光，說(shuō)明標(biāo)記基因在Rs91-GFP中的穩(wěn)定性很高，移植20次后熒光穩(wěn)定性仍然保持在100%（表1）。 圖6 Rs91-GFP的熒光素酶活性檢測(cè)Fig. 6 The luminometry activity during the fermentation of R. solanacearum strain Rs91-GFP2.5 Rs91-GFP的生長(zhǎng)特性表1 Rs91-GFP的穩(wěn)定性Table 1 Effect of R. solanac

30、earum strain Rs91-GFP continuous transfer on the fluorescence stability移植次數(shù) Time for cultural transfer28121620培養(yǎng)時(shí)間 Culture time (h)2496144192240菌體數(shù)量 CFU(×106)190181138178209熒光強(qiáng)度 Luminescence intensity+發(fā)光菌體比例 Ratio of the luminescent bacteria (%)100100100100100+：強(qiáng)；+：中；+：弱+: Strong; +: Medium; +:

31、 Weak2.5.1 Rs91-GFP生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 Rs91和Rs91-GFP的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線如圖7所示。在相同的培養(yǎng)條件下，Rs91和Rs91-GFP的生長(zhǎng)曲線的變化趨勢(shì)基本相同。但是從生長(zhǎng)速度上看，Rs91-GFP明顯滯后，在初始培養(yǎng)的3 h時(shí)，Rs91和Rs91-GFP的OD600分別為0.129和0.121，二者基本相同；在生長(zhǎng)5 h后，Rs91和Rs91-GFP均進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其延續(xù)時(shí)間和OD600均有所不同，Rs91的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為515 h，OD600為0.1741.164；Rs91-GFP的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為519 h，OD600為0.1390.171。之后，Rs91和Rs91-G

32、FP均進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。2.5.2 溫度對(duì)Rs91-GFP生長(zhǎng)的影響 Rs91和Rs91-GFP在不同溫度下的生長(zhǎng)情況沒(méi)有顯著性差異（P0.01）。隨著溫度的升高，Rs91和Rs91-GFP的生長(zhǎng)迅速加快，但是如果溫度過(guò)高，生長(zhǎng)就會(huì)變得緩慢。培養(yǎng)溫度為20時(shí)，Rs91和Rs91-GFP生長(zhǎng)緩慢，其OD600分別為0.414和0.459；培養(yǎng)溫度為35時(shí)，青枯雷爾氏菌Rs91和Rs91-GFP生長(zhǎng)迅速，其OD600圖7 青枯雷爾氏菌Rs91-GFP菌株的生長(zhǎng)曲線Fig. 7 The growth curve of the Rs91-GFP strain分別為3.255和2.119；當(dāng)培養(yǎng)溫度提高為

33、40時(shí)，Rs91和Rs91-GFP的生長(zhǎng)略有緩慢，其OD600分別為2.238和2.129?？傮w看來(lái)，Rs91和Rs91-GFP的最適宜培養(yǎng)溫度為35。青枯雷爾氏菌進(jìn)行g(shù)fp基因轉(zhuǎn)化后，不同生長(zhǎng)溫度對(duì)其生長(zhǎng)的影響沒(méi)有改變，與轉(zhuǎn)化前一致（圖8）。圖8 溫度對(duì)青枯雷爾氏菌Rs91-GFP菌株生長(zhǎng)的影響Fig. 8 The effect of temperature on the growth of the Ralstonia solanacearum strain Rs91-GFP2.5.3 初始pH對(duì)Rs91-GFP生長(zhǎng)的影響 青枯雷爾氏菌Rs91和Rs91-GFP在初始pH下的生長(zhǎng)情況沒(méi)有顯著

34、性差異（P0.01）。隨著培養(yǎng)初始pH的升高，Rs91和Rs91-GFP呈現(xiàn)先升高后降低的生長(zhǎng)趨勢(shì)。在pH為5.0時(shí)，Rs91的OD600為0.869，Rs91-GFP的OD600為0.999，二者的生長(zhǎng)較為緩慢，當(dāng)pH由偏酸變?yōu)橹行詴r(shí)，二者的生長(zhǎng)也加快，當(dāng)pH為7.0時(shí)，達(dá)到最大，Rs91的OD600為1.353，Rs91-GFP的OD600為1.679；隨著pH變?yōu)閴A性，Rs91和Rs91-GFP的生長(zhǎng)又逐漸變得緩慢，當(dāng)pH為9.0時(shí)，Rs91的OD600為0.908，Rs91-GFP的OD600為1.152，二者生長(zhǎng)速度不如pH中性條件下的生長(zhǎng)速度快?？偟目磥?lái)，青枯雷爾氏菌進(jìn)行g(shù)fp基因

35、轉(zhuǎn)化前后，在中性的條件下生長(zhǎng)最好（圖9）。圖9 pH對(duì)Rs91-GFP生長(zhǎng)的影響Fig. 9 The effect of pH value on the growth of the Ralstonia solanacearum strains Rs91-GFP2.6 Rs91-GFP菌株的定殖和侵染特性2.6.1 溫度對(duì)Rs91-GFP定殖的影響 不同溫度下Rs91-GFP菌株對(duì)番茄組培苗整株的定殖見(jiàn)圖10。在接種72 h后，番茄組培苗整株含菌量不同，當(dāng)培養(yǎng)溫度為19時(shí)，番茄組培苗整株中Rs91-GFP含量為65.92×104 cfu·g-1，當(dāng)培養(yǎng)溫度提高時(shí)，Rs91-G

36、FP含量也隨之提高，當(dāng)培養(yǎng)溫度為25時(shí)，Rs91-GFP含量為269.07×104 cfu·g-1，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28時(shí)，Rs91-GFP含量達(dá)到最大值，為1 805.03×104 cfu·g-1，當(dāng)培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高，到31時(shí)，番茄組培苗整株中Rs91-GFP含量隨著溫度的升高，反而下降為586.3×104 cfu·g-1。因此，不同溫度對(duì)番茄組培苗整株中Rs91-GFP含量具有不同的影響，在研究番茄組培苗中Rs91-GFP定殖的最佳培養(yǎng)溫度為28。圖10 溫度對(duì)青枯雷爾氏菌Rs91-GFP定殖的影響Fig. 10 The effect

37、 of different temperatures on the infection of the R. solanacearum strain Rs91-GFP the roots of tomato plants2.6.2 青枯雷爾氏菌Rs91-GFP在番茄組培苗體內(nèi)轉(zhuǎn)移路線的測(cè)定 在番茄組培苗培養(yǎng)9 h后，首先在根部出現(xiàn)青枯雷爾氏菌Rs91-GFP，菌體數(shù)量為0.75×105 cfu·g-1，在培養(yǎng)的12 h后，莖基部出現(xiàn)青枯雷爾氏菌Rs91-GFP，菌體數(shù)量為0.591×105 cfu·g-1，莖上部和葉部還沒(méi)出現(xiàn)青枯雷爾氏菌Rs91-GFP；

38、培養(yǎng)的15 h后，青枯雷爾氏菌Rs91-GFP已經(jīng)到達(dá)葉部，在葉片的菌體數(shù)量為0.262×105 cfu·g-1。在培養(yǎng)的18 h后，番茄組培苗的各部位均可檢測(cè)到青枯雷爾氏菌Rs91- GFP，由此可見(jiàn)，Rs91-GFP在番茄組培苗的轉(zhuǎn)移路線由番茄組培苗的根部開(kāi)始，逐漸向頂部轉(zhuǎn)移（表2）。2.6.3 青枯雷爾氏菌Rs91-GFP對(duì)番茄組培苗致病性影響 gfp基因標(biāo)記前后的青枯雷爾氏菌對(duì)番茄組培表2 青枯雷爾氏菌Rs91-GFP在番茄組培苗不同部位的含量Table 2 The growth routes of the Ralstonia solanacearum strain

39、 Rs91-GFP in the tomato plants (×105 cfu·g-1)培養(yǎng)時(shí)間 Culture time (h)91215182124根部 Root0.754.9035.612.516.436.7莖基部 Base stem00.5910.110.2170.12234.88莖頂部 Top stem000.5960.0670.2380.412葉片Leaf000.2620.5533.252.85苗的致病性無(wú)顯著性差異（P0.01）。Rs91和Rs91-GFP侵染24 h后的死亡率分別為14%和12%；侵染48 h后的死亡率分別為35%和30%；侵染72 h后的

40、死亡率分別為65%和60%；在侵染92 h，死亡率均達(dá)到90%以上。從致病性上可以看出，gfp基因的標(biāo)記并不會(huì)影響菌株的侵染能力（圖11）。圖11 青枯雷爾氏菌Rs91-GFP菌株對(duì)番茄組培苗致病性影響Fig. 11 The pathogenicity of the Ralstonia solanacearum strains of Rs91-GFP and Rs913 討論gfp基因和luxAB基因是目前應(yīng)用較為廣泛的兩種標(biāo)記基因9,1214。應(yīng)用gfp/luxAB雙標(biāo)記系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是可以增強(qiáng)檢測(cè)的特異性及靈敏度，雖然二者都是利用它們表達(dá)產(chǎn)物的熒光特性對(duì)標(biāo)記物細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，但二者的發(fā)光機(jī)制不同

41、，GFP的發(fā)光不需要底物，而熒光素酶需要催化底物后才能發(fā)光，利用這個(gè)不同點(diǎn)將兩個(gè)基因融合并在靶標(biāo)細(xì)菌中表達(dá)后可以同時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞總的數(shù)量及其能量狀況9。目前未見(jiàn)采用gfp/luxAB雙標(biāo)記系統(tǒng)進(jìn)行青枯雷爾氏菌的標(biāo)記及相關(guān)研究的報(bào)道。熒光素酶檢測(cè)的最大優(yōu)點(diǎn)是不損害監(jiān)測(cè)對(duì)象，便于在整體水平或離體器官內(nèi)測(cè)定基因產(chǎn)物是否表達(dá)15。De Weger等16將lux基因?qū)胫参锔鼍?，通過(guò)發(fā)光檢測(cè)設(shè)備監(jiān)測(cè)指示菌生成的光線，在線監(jiān)測(cè)了細(xì)菌侵入植物的整個(gè)過(guò)程。本研究成功地采用luxAB標(biāo)記了青枯雷爾氏菌，并對(duì)其熒光素酶活性進(jìn)行了定時(shí)檢測(cè)。結(jié)果表明在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，熒光素酶活性呈線性遞增，到了穩(wěn)定期，由于代謝能力下降導(dǎo)

42、致熒光素酶活性逐漸降低。由于熒光素酶表達(dá)的檢測(cè)不受活體材料的影響，因此，可以直接利用其監(jiān)測(cè)標(biāo)記菌株侵入植株的整個(gè)過(guò)程，為進(jìn)行青枯雷爾氏菌的侵染過(guò)程的觀察提供直觀的檢測(cè)工具。李法峰等17用Tn5轉(zhuǎn)座誘變糞產(chǎn)堿菌后，一株轉(zhuǎn)化子由于Tn5轉(zhuǎn)座片段的插入使該菌株以色氨酸為前體的IAA合成途徑被阻斷。因此，外源基因在目標(biāo)菌株中的轉(zhuǎn)化只是成功的第一步，而接下來(lái)對(duì)插入型標(biāo)記菌株的形態(tài)特征、生長(zhǎng)及生理特性進(jìn)行研究是很有必要的。本研究中采用顯微鏡對(duì)標(biāo)記前后兩個(gè)菌株菌落及菌體形態(tài)的觀察結(jié)果表明，標(biāo)記菌株的菌體形態(tài)同野生型青枯雷爾氏菌的菌體相似。對(duì)兩個(gè)菌株生長(zhǎng)曲線的比較來(lái)看，外源基因整合到目標(biāo)青枯雷爾氏菌的基因組后

43、，由于外源基因的隨機(jī)插入可能影響到細(xì)菌代謝過(guò)程所需的某些酶的正常表達(dá)，因而與出發(fā)菌株相比生長(zhǎng)勢(shì)有所減弱。這種由于外源基因插入而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化株生長(zhǎng)滯后的現(xiàn)象在別的菌株中也有出現(xiàn)，如馮永君等18在比較水稻內(nèi)生優(yōu)勢(shì)成團(tuán)泛菌YSl9及其GFP標(biāo)記的YSl9B：gfp菌株的生長(zhǎng)后指出，與野生型菌株相比，標(biāo)記菌株的代時(shí)延長(zhǎng)了14%。微生物的生命活動(dòng)是由一系列生物化學(xué)反應(yīng)組成的，而這些反應(yīng)受環(huán)境因子如溫度和pH的影響極為明顯，因此溫度和pH也是決定細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)物質(zhì)量的一個(gè)很重要的因素。更重要的是溫度還可能影響綠色熒光蛋白在標(biāo)記菌株中的表達(dá)19，本研究結(jié)果表明，外界基因的插入不會(huì)影響青枯雷爾氏菌培養(yǎng)的最適宜生長(zhǎng)溫

44、度和最適宜pH范圍，兩個(gè)菌株最適生長(zhǎng)溫度均為30，最適pH為7.0，以上這些結(jié)果為標(biāo)記菌株的發(fā)酵培養(yǎng)應(yīng)用提供了重要的技術(shù)參數(shù)。本研究中標(biāo)記的青枯雷爾氏菌在0.1×TSB培養(yǎng)基非選擇性培養(yǎng)基中每隔12 h連續(xù)移植20次后，還能檢測(cè)到100%的GFP熒光細(xì)胞，這種GFP熒光的高度穩(wěn)定性部分歸功于GFP的晶體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性20,9。另外被廣泛認(rèn)同的觀點(diǎn)是，與帶有g(shù)fp基因的質(zhì)粒型轉(zhuǎn)化子相比，gfp通過(guò)轉(zhuǎn)座載體整合到細(xì)菌染色體后的表達(dá)更穩(wěn)定21。例如，Leff等22用帶有g(shù)fp基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli，并用這個(gè)質(zhì)粒介導(dǎo)的gfp基因作為標(biāo)記監(jiān)測(cè)GEMs在水環(huán)境中的存活能力，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒上攜帶的

45、gfp基因在幾天內(nèi)就丟失了，而gfp基因插入Pseudomonas sp. 染色體后，GFP標(biāo)記的菌株接種到土壤中13個(gè)月后還能檢測(cè)到。從1996年起，GFP標(biāo)記系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于各種環(huán)境微生物研究中，如水環(huán)境23、土壤21、根際24、葉片25、生物被膜26等。一旦某個(gè)菌株被標(biāo)記了gfp基因，就可以很容易地通過(guò)綠色熒光這個(gè)表現(xiàn)型來(lái)監(jiān)測(cè)這個(gè)菌群內(nèi)表達(dá)gfp的細(xì)胞。最常用的檢測(cè)方法是平板計(jì)數(shù)法，它只需在普通的近紫外光源照射下就可監(jiān)測(cè)發(fā)綠色熒光的菌落數(shù)，這是一種實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，簡(jiǎn)單、直觀而且成本低。本研究利用平板計(jì)數(shù)法觀察了GFP標(biāo)記的青枯雷爾氏菌在番茄組培苗內(nèi)的定殖情況。研究結(jié)果表明，標(biāo)記菌株在接

46、種后的9 h后在根部出現(xiàn)，12 h后莖基部出現(xiàn)青枯雷爾氏菌，莖上部和葉部還沒(méi)出現(xiàn)青枯雷爾氏菌，15 h后青枯雷爾氏菌已經(jīng)到達(dá)葉部，在以后的時(shí)間各部位都有青枯雷爾氏菌。周俊初等27通過(guò)激光共聚焦顯微鏡成功地觀察并記錄了gfp標(biāo)記的根瘤菌在紫云英幼苗根部的定殖、感染及幼小根瘤與成熟根瘤不同層面中由gfp表達(dá)的綠色熒光。近年來(lái)，隨著遺傳工程微生物（GEMs）在生物防治、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和生物降解等農(nóng)業(yè)及環(huán)保各個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，GEMs在環(huán)境中釋放后的安全性問(wèn)題也日益受到重視。因?yàn)閹в兄亟MDNA的微生物經(jīng)人為釋放到環(huán)境中后，重組DNA有可能通過(guò)細(xì)菌間基因水平的交換進(jìn)行不受控制的基因飄移，并可能產(chǎn)生不良后果

47、，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)自然遺傳轉(zhuǎn)化可以在細(xì)菌間進(jìn)行28,29。因此GFP標(biāo)記系統(tǒng)不僅對(duì)農(nóng)業(yè)或環(huán)境有益微生物的定殖活動(dòng)、作用方式及作用機(jī)理的研究具有重要意義，而且還將成為GEMS在環(huán)境中釋放后安全性研究的一種有效的手段。青枯雷爾氏菌綠色熒光蛋白標(biāo)記的成功，將有助于研究青枯雷爾氏菌對(duì)活體植物的侵染機(jī)制，避免了傳統(tǒng)分離方法的繁瑣步驟，以及其它相似細(xì)菌的相互影響，同時(shí)還可以利用熒光與菌細(xì)胞成線性關(guān)系，建立菌體生物量的直觀測(cè)定方法，并為研究青枯雷爾氏菌的致弱機(jī)理及生物防治奠定了基礎(chǔ)。4 結(jié)論采用gfp基因標(biāo)記了青枯雷爾氏菌（Rs91），標(biāo)記后的菌株（Rs91-GFP）的菌體細(xì)胞形狀與親本菌株形狀相同，均為長(zhǎng)橢圓

48、形，近桿狀，整個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。從Rs91-GFP菌株的基因組DNA中擴(kuò)增出約3.0 kb的gfp基因片段。Rs91-GFP在的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，熒光素酶活性快速增加，到了穩(wěn)定期，熒光素酶活性降低。Rs91-GFP的生長(zhǎng)速度較Rs91緩慢。在無(wú)選擇壓力條件下連續(xù)移植20次，Rs91-GFP所有菌落都仍然保持均勻而且強(qiáng)烈的綠色熒光，熒光穩(wěn)定性保持在100%。Rs91-GFP和Rs91在培養(yǎng)的最適溫度、最佳pH值及生長(zhǎng)曲線上基本一致。Rs91-GFP和Rs91在番茄組培苗內(nèi)的侵染路線相同，致病力均達(dá)到90%以上。致謝：本研究的大部分工作是在瑞典農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物系Janet K. Jansson教授實(shí)驗(yàn)室

49、完成；感謝國(guó)家外專局和福建省外專局對(duì)作者工作給予的支持；感謝Janet K. Jasson教授提供pUTgfplux（mini-Tn5）轉(zhuǎn)座載體；深切感謝Janet K. Jasson教授及實(shí)驗(yàn)室的博士生及實(shí)驗(yàn)室管理員在瑞典期間給予本人的熱心指導(dǎo)和試驗(yàn)所需要的大量?jī)x器和試劑的無(wú)償提供!References1馮 莉, 張玲華, 田興山. 青枯菌致病性與基因組之間的關(guān)系. 生物技術(shù)通訊, 2007, 18(2): 357-359. Feng L, Zhang L H, Tian X S. The relationship between pathogenicity and genome of Ra

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