霍亂弧菌致病因子誘導(dǎo)人腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

1、霍亂弧菌致病因子誘導(dǎo)人腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究         11-03-24 10:13:00     作者：歐剛衛(wèi)     編輯：studa20【摘要】  目的： 鑒定誘導(dǎo)人腸上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)的霍亂弧菌分泌產(chǎn)物。方法： 野生型霍亂弧菌O1株C6706及其變異株培養(yǎng)上清刺激極化的人單層腸上皮T84細(xì)胞體外模型上層腔面，分析細(xì)胞受刺激后通透性和細(xì)胞活性以及白細(xì)胞介素8(IL8)、腫瘤壞死因子(TNF)基因表達(dá)改變；分析上

2、清中霍亂弧菌蛋白酶(Vibrio cholerae protease,PrtV)和霍亂弧菌溶細(xì)胞素(Vibrio cholera cytolysin，VCC)含量以及溶血能力。結(jié)果： PrtV缺失株培養(yǎng)上清可引起T84細(xì)胞層的炎性反應(yīng)，表現(xiàn)為通透性增加和IL8,TNF基因表達(dá)增加。腸上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)及紅細(xì)胞溶血反應(yīng)與VCC活性有關(guān)。結(jié)論： VCC是霍亂弧菌引起人腸上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)的主要因素，PrtV通過降解VCC而降低對(duì)腸上皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)。 【關(guān)鍵詞】  霍亂弧菌蛋白酶； 霍亂弧菌溶細(xì)胞素； 人單層腸上皮細(xì)胞； 炎性反應(yīng)AbstractObjective: To identify

3、the secreted component(s) of V.cholerae that induces an intestinal epithelial inflammatory response.  Methods： Culture supernatants of wild type Vibrio cholerae O1 strain C6706 and its derivates were analyzed for capacity to induce changes in cytokine mRNA expression levels, IL8 and TNF  s

4、ecretion, permeability and cell viability when added to the apical side of polarized tight monolayer T84 cells used as an in vitro model for human intestinal epithelium. Culture supernatants were also analyzed for PrtV and VCC content by immunoblot analyses and for hemolytic capacity.   Re

5、sults： Experiments with culture supernatants of different V.cholerae derivates suggested that VCC was capable of causing an inflammatory response characterized by increased permeability and production of IL8 and TNF  in tight monolayers. Capacity to induce this response in epithelial cells corr

6、elated to VCC content and hemolytic activity. Conclusion： The findings suggested that VCC induced the human intestinal epithelial inflammatory response. Furthermore, PrtV can mediate an environment dependent modulation of VCC induced inflammatory response.Key wordsVibrio cholerae protease;  Vib

7、rio cholera cytolysin;  human intestinal epithelial cells; inflammatory response     霍亂弧菌是霍亂的病原菌，人群通過攝入霍亂弧菌污染的水或食物引起腹瀉性疾病?；魜y弧菌分泌的霍亂毒素(cholera toxin，CTX)是引起腹瀉的主要因素。然而，大多數(shù)霍亂弧菌疫苗篩選菌株在臨床實(shí)驗(yàn)中仍然表現(xiàn)出免疫反應(yīng)性1，其作用的分子和細(xì)胞機(jī)理仍然不清楚。Levine等2發(fā)現(xiàn)一種先前未明確的腸道毒素在CTX缺失株可引起某些腸道癥狀，這些癥狀通常在CTX陽性菌株中被CTX引起的消化道癥狀

8、掩蓋。這些腸道毒素可能是霍亂弧菌分泌的血液凝結(jié)蛋白酶(hemagglutinationprotease, Hap protease)3、多功能的RTX毒素(repeats in toxin)4和霍亂弧菌溶細(xì)胞素(Vibrio cholera cytolysin，VCC)5。    使用逆向分子遺傳學(xué)方法，Vaitkevicius等6,7在霍亂弧菌O1株C6706發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌蛋白酶(Vibrio cholerae protease, PrtV)與抗天然原生動(dòng)物如鞭毛蟲和纖毛蟲的捕食有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PrtV是霍亂弧菌定殖于美麗桿線蟲（Caenorhabditis

9、 elegans，C.elegans）腸道并最后促使線蟲死亡的必需因素。由此假設(shè)霍亂弧菌疫苗試驗(yàn)中志愿者腸道炎癥反應(yīng)可能是由霍亂弧菌蛋白酶PrtV引起的。然而，用人84腸道上皮細(xì)胞極化緊密單層細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PrtV不是腸道上皮細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素8(interlukine8, IL8)的刺激因素，反而可降低由其他尚未明確的霍亂弧菌分泌因子引起的IL8表達(dá)6。為了進(jìn)一步理解PrtV對(duì)于人和線蟲腸道上皮細(xì)胞完全不同的作用，本文研究了霍亂弧菌分泌因子中引起人腸細(xì)胞炎性反應(yīng)的成分及其相互關(guān)系。    1  材料與方法    1

10、.1  細(xì)菌菌株及培養(yǎng)    使用的細(xì)菌菌株見表1，所有細(xì)菌培養(yǎng)在20 ml含30 g/ml卡那霉素(kanamycin)LB培養(yǎng)基或含50 g/ml氨芐西林(ampicillin)腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基，37 200 r/min振搖過夜，培養(yǎng)上清用無菌過濾器過濾?；魜y弧菌變異株構(gòu)建按照文獻(xiàn)8進(jìn)行。表1  實(shí)驗(yàn)所用菌株，Tab 1  Bacterial strains（略）1.2  腸上皮單層細(xì)胞培養(yǎng)    參照文獻(xiàn)9將人腸上皮T84細(xì)胞株培養(yǎng)在半透膜支持物上形成極化的人單層腸上皮細(xì)胞體外模型

11、。當(dāng)模型跨上皮細(xì)胞膜電阻(transepithelial electrical resistance, TER)1 000 Ohm/cm2 時(shí)，用不同霍亂弧菌菌株培養(yǎng)上清替換上室細(xì)胞培養(yǎng)基。單層腸上皮細(xì)胞在含5%CO2，37細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 h，測定TER后，收集下室培養(yǎng)液用于細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量分析。收集細(xì)胞，用PBS清洗2次后保存于1 ml 含4 mol/L 異硫氰酸胍、25 mmol/L枸櫞酸鈉、0.5% N月桂酰基肌氨酸、0.1 mol/L 2巰基乙醇(pH 7.0)溶液中，用于RNA提取。    1.3  IL8和TNF mRNA水平的測定

12、    總RNA提取參照文獻(xiàn)9用酸性異硫氰酸胍酚三氯甲烷法。提取的RNA溶解于含1 000 U/ml核酸酶抑制劑RNasin(Promega公司)的無核酸酶水中并保存于-80。    IL8和TNF mRNA含量用即時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRTPCR)法。并采用TaqMan EZ技術(shù),以18S rRNA為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。測定結(jié)果表示為每18S rRNA單位mRNA拷貝數(shù)。    1.4  IL8和TNF分泌量測定    使用人IL8和TNF酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒分別測

13、定從單層細(xì)胞培養(yǎng)下室中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液中IL8和TNF的含量。    1.5  溶血活性測定    參照文獻(xiàn)10方法測定血紅蛋白釋放量確定溶血活性。8%兔紅細(xì)胞懸浮于含0.1%明膠的PBS。50 l細(xì)胞懸液加到預(yù)先加入含50 l不同菌株過夜培養(yǎng)上清系列稀釋液的96微孔板中，微孔板在37溫育120 min，然后1 800 g離心10 min，分別從每孔中轉(zhuǎn)移50  l上清到新的96微孔板中，用酶標(biāo)儀在540 nm讀取光密度值。    1.6  蛋白印跡分析VCC和PrtV含量    蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至二氟化樹脂膜(PVDF)。用抗VCC和抗PrtV兔抗血清分別稀釋110 000 和1200 000鑒定蛋白質(zhì)?？雇妹庖咔虻鞍着悸?lián)的辣根過氧化物酶(HRP)為二抗，最終稀釋度為120 000。電致發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)用于檢測化學(xué)發(fā)光水平，并用凝膠