龍眼參黃酮抗心肌缺血再灌注引起的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的研究

1、龍眼參黃酮抗心肌缺血再灌注引起的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的研究         09-09-09 17:03:00     編輯：studa20                  作者：張緒東，蔣偉哲，焦陽(yáng)，黃仁彬【摘要】  目的 探討龍眼參黃酮（Longyanshen flavonoids,LF）對(duì)大鼠心肌

2、缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion,MIR)引起的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的影響。方法60只健康SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、缺血再灌注(MIR)組、生理鹽水(normal saline,NS)組和3個(gè)預(yù)處理組(LF低劑量組、LF中劑量組、LF高劑量組)，各組大鼠雌、雄各半。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30min后，再灌注60min，建立MIR模型。用不同劑量LF在結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支前30min分別做預(yù)處理。再灌注結(jié)束后采血，測(cè)定血漿中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GS

3、H-Px)和丙二醛(MDA)的改變，測(cè)量心肌梗塞范圍。結(jié)果與MIR組比較，LF預(yù)處理能明顯降低血漿中AST，CK，CK-MB和MDA含量，能提高SOD，GSH-Px活性，降低心肌梗塞范圍。結(jié)論LF對(duì)大鼠MIR引起的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷具有顯著的保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】  龍眼參； 黃酮； 心肌缺血再灌注; 脂質(zhì)過(guò)氧化損傷Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of Longyanshen flavonoids (LF) on lipid peroxidation injury induced by myocardial ischemia

4、reperfusion(MIR) in Sprague Dawley (SD) rats.MethodsSixty healthy SD rats were randomly divided into sham operation(Sham) group, MIR group, normal saline(NS) group,and three pretreated groups(LF low dose group,LF medium dose group and LF high dose group),with half female and half male rats in each g

5、roup. MIR model was established by ligating left anterior descending coronary artery for 30 min followed by reperfusion for 60 min in rats.Different dosages of LF were administered 30 min before ligating left anterior descending coronary artery in every pretreated group. Blood was collected at the e

6、nd of reperfusion for detecting the changes of aspartate aminotransferase(AST),creatine kinase(CK),creatine kinase isoenzyme MB(CK-MB),superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxydase(GSH-Px), malondialdehyde(MDA).The myocardial infarct size was measured after reperfusion. ResultsLF preconditioning

7、 could significantly decrease the contents of AST,CK,CK-MB and MDA, and the myocardial infarct size,and increase the activities of SOD and GSH-Px.ConclusionLF has a significant protective effect against lipid peroxidation injury induced by myocardial ischemia reperfusion in rats.Key words:Longyanshe

8、n;  Flavonoids;  Myocardial ischemia reperfusion;  Lipid peroxidation injury    龍眼參Longyanshen，LYS原植物經(jīng)考證為蝶形花科植物疏葉崖豆Millettia pulchra Kurz var-laxior(Dunn) Z.Wei的塊根，是廣西民間廣泛應(yīng)用的壯藥。本課題組對(duì)龍眼參進(jìn)行了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)龍眼參水提取物具有減輕心肌缺血再灌注性損傷、抗羥自由基和氧自由基等1，2作用，而龍眼參提取物龍眼參總黃酮是否具有抗心肌缺血再灌注引起的脂質(zhì)過(guò)氧化

9、損傷作用未見報(bào)道?，F(xiàn)將其抗心肌缺血再灌注引起的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷作用及可能的作用機(jī)制報(bào)道如下。1  器材與方法1.1  動(dòng)物 60只健康SD大鼠，廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重(230±20)g，雌雄各半。1.2  試劑與儀器 龍眼參黃酮,廣西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室自行提取制備。伊文思藍(lán)(Evan blue)和氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)購(gòu)自Sigma公司。MDA，SOD，GSH-Px試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。AST，CK，CK-MB購(gòu)自英國(guó)朗道（RANDOX）公司。動(dòng)物

10、呼吸機(jī)ALC-V8，上海奧爾科特生物科技有限公司產(chǎn)品。日本日立(HITACHI)7170生化分析儀，日本日立公司產(chǎn)品。TGL-16G-A高速冷凍離心機(jī)，上海安亨科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。722N可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。MS4000U生物信號(hào)定量記錄分析系統(tǒng)，廣州市龍飛達(dá)科技有限公司。1.3 分組與給藥方法將SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半：假手術(shù)(Sham)組；缺血再灌注(MIR)組；生理鹽水(NS)組：缺血前30 min經(jīng)十二指腸注射生理鹽水2 ml·kg-1；LF低劑量組：缺血前30 min經(jīng)十二指腸注射LF 20 mg·kg-1；LF中劑量組：缺血前

11、30 min經(jīng)十二指腸注射LF 40 mg·kg-1；LF高劑量組:缺血前30 min經(jīng)十二指腸注射LF 80 mg·kg-1。1.4 建立缺血再灌注模型 各組大鼠以20%烏拉坦腹腔注射麻醉（5 ml/kg體重），仰臥位固定。將銀針電極插入四肢皮下，連接MS4000U生物信號(hào)定量記錄分析系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。分離氣管并插管后立即正壓人工呼吸(呼吸頻率70次/min，潮氣量50 ml/kg，吸呼比12)。從左側(cè)第3，4肋間打開胸腔。暴露心臟，剪破心包膜，在肺動(dòng)脈圓錐左緣與左心耳右緣之間，平左心耳下緣2 mm處進(jìn)針，進(jìn)針深度12 mm，寬度23 mm,用5/0無(wú)損

12、傷縫合線穿過(guò)心肌層，繞過(guò)冠狀動(dòng)脈左前降支，除假手術(shù)組不結(jié)扎外，其余組均結(jié)扎。30 min后解除結(jié)扎，再灌注60 min。以心電圖ST段抬高、T波高聳作為心肌缺血的標(biāo)志；以抬高的ST段下降，T波逐漸恢復(fù)確定再灌注的成功。再灌注結(jié)束后，從腹主動(dòng)脈采血2 ml，離心（04，3 000 r/min，離心15 min），取上層血漿凍存?zhèn)溆谩?.5  心肌梗塞面積測(cè)量 再灌注結(jié)束后，將冠狀動(dòng)脈左前降支原位重新結(jié)扎，由主動(dòng)脈逆行注入0.5 g·L-1的伊文思藍(lán)1.5 ml，待心臟非缺血區(qū)充分染成藍(lán)色后，摘取心臟，用冰生理鹽水(4)將心臟清洗干凈，剪去心底組織、心耳及右心室，置于

13、-80冰箱速凍5 min，然后自心尖向心底平行于房室溝方向?qū)⒆笫仪谐?1.5 mm厚的薄片。將心臟切片置于pH 7.4的10 g·L-1TTC磷酸鹽緩沖液中，37孵育15 min。冷鹽水沖洗去游離染料，10%甲醛固定。染成藍(lán)色的區(qū)域代表非缺血區(qū)，紅色區(qū)域（含白色區(qū)）代表缺血區(qū)，白色區(qū)域代表梗塞區(qū)。沿著不同顏色的邊緣切下不同區(qū)域并稱重，分別以心肌梗塞區(qū)重量(infarct weight，IW)、缺血區(qū)重量(weight of risk WR)占左室重量(weight of left ventricular，WLV)的百分比(IW/WLV)%、(WR/WLV)%反映心肌梗塞范圍、心肌缺血

14、范圍。     09-09-09 17:03:00     編輯：studa201.6  血漿心肌酶測(cè)定 采用日本日立(HITACHI)7170生化分析儀檢測(cè)血漿AST，CK，CK-MB水平。1.7  血漿SOD，GSH-Px，MDA測(cè)定 按試劑盒方法測(cè)定SOD活力，GSH-Px，MDA含量。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)。2  結(jié)果2.1  血漿心肌酶的變化MIR組

15、血漿各心肌酶均明顯高于Sham組(P<0.01)，MIR組與NS組比較，無(wú)顯著性差異(P>0.05)，LF中劑量組、LF高劑量組血漿各心肌酶明顯低于MIR組(P<0.01)。結(jié)果見表1。表1  龍眼參黃酮對(duì)MIR血漿心肌酶學(xué)的影響(略)2.2  血漿SOD，GSH-Px ，MDA的變化 MIR組血漿MDA含量明顯高于Sham組(P<0.01)，與NS組無(wú)差異(P>0.05)，明顯高于LF各組(P<0.01或P<0.05)；MIR組SOD，GSH-Px活性明顯低于Sham組(P<0.01)，與NS組無(wú)顯著性差異(P&g

16、t;0.05)，明顯低于LF高、中劑量組(P<0.01)。結(jié)果見表2。表2  龍眼參黃酮對(duì)MIR血漿SOD，GSH-Px，MDA的影響（略）2.3  心肌梗塞范圍的變化 從缺血區(qū)占左心室重量百分比看，各組間無(wú)顯著性差異(P>0.05);從梗塞區(qū)占左心室重量百分比看，MIR組與NS組無(wú)差異(P>0.05)，LF組高、中劑量組明顯低于MIR組(P<0.01或P<0.05)。結(jié)果見表3。表3  龍眼參黃酮對(duì)MIR心肌梗塞范圍的影響（略）3  討論    心肌持續(xù)一段時(shí)間缺血后重新恢復(fù)血液灌注

17、,心肌的結(jié)構(gòu)和功能不僅沒能恢復(fù),反而加重了心肌的結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙,這種現(xiàn)象醫(yī)學(xué)上稱之為心肌缺血再灌注（myocardial ischemia reperfusion，MIR）損傷3，4。采用大鼠復(fù)制MIR模型被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛采用5。由于雌激素對(duì)心肌缺血有保護(hù)作用6，7，許多學(xué)者在研究MIR時(shí)，選擇雄性動(dòng)物。最近Primo Kuhar等8報(bào)道，雄激素同樣對(duì)心肌缺血有保護(hù)作用，所以本實(shí)驗(yàn)研究選擇SD大鼠雌雄各半。    正常生理情況下，細(xì)胞內(nèi)有自由基清除劑超氧化物歧化酶(SOD)使氧自由基轉(zhuǎn)變?yōu)檫^(guò)氧化氫(H2O2)，后者又通過(guò)過(guò)氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶

18、(GSH-Px)的作用還原為水和分子氧,自由基產(chǎn)生與清除保持著動(dòng)態(tài)平衡。急性心肌缺血和復(fù)灌時(shí)，由于組織缺氧、呼吸鏈抑制、NADH(還原型輔酶I)堆積、兒茶酚胺增多和游離脂肪酸堆積，使得膜脂質(zhì)的分子氧不能全部還原，經(jīng)加氧酶系產(chǎn)生大量自由基;自由基氧化膜上的不飽和脂肪酸，使脂肪變性形成過(guò)氧化脂質(zhì)。在形成過(guò)氧化脂質(zhì)過(guò)程中，過(guò)氧化又可產(chǎn)生自由基，引起大量氧自由基產(chǎn)生911。    氧自由基(OFR)生成增多，而清除OFR的酶類SOD,GSH-Px等活性降低，造成脂質(zhì)過(guò)氧化物損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等，使膜的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞是缺血再灌注損傷的主要機(jī)制之一12，13。 

19、   當(dāng)心肌細(xì)胞受損傷時(shí)，AST，CK等可漏出到血液中，檢測(cè)血漿心肌酶，尤其是心肌同工酶如CK-MB等可以反映心肌受損程度。MDA是自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化終末代謝產(chǎn)物，因此測(cè)定MDA值能反映氧自由基的含量和脂質(zhì)過(guò)氧化程度。SOD，GSH-Px是體內(nèi)清除氧自由基抗氧化酶系統(tǒng)的成員，檢測(cè)SOD，GSH-Px活性能反映機(jī)體內(nèi)抗脂質(zhì)過(guò)氧化的能力14，15。因此，我們針對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的環(huán)節(jié)，研究龍眼參黃酮對(duì)心肌缺血再灌注的保護(hù)作用是可行的。    本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，MIR組血漿各心肌酶、MDA含量明顯升高(P<0.01)，SOD，

20、GSH-Px活性明顯低于Sham組(P<0.01)，(IW/WLV)%增高，各組的(WR/WLV)%無(wú)差異(P>0.05), 表明結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的位置基本一致，造模成功；與MIR組比較，LF中劑量組、LF高劑量組可以明顯降低MDA含量(P<0.01)、升高SOD、GSH-Px活性(P<0.01)、減少心肌酶漏出(P<0.01)，降低梗塞范圍(P<0.01或P<0.05)。結(jié)合以往的研究1，2，提示LF對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌注具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與清除氧自由基，保護(hù)氧自由基清除酶活性，減少心肌酶釋放，抗脂質(zhì)過(guò)氧化，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化所致心肌細(xì)胞膜的損傷等有關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1焦楊，段小群，孔曉龍，等.玉郎傘提取物對(duì)大鼠心肌缺血再灌注的保護(hù)作用J.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24(12):726.2焦楊，段小群，黃仁彬，等.玉郎傘提取物對(duì)超氧陰離子自由基和羥自由基的抑制和清除作用J.廣西醫(yī)科大學(xué)報(bào),2004,21(1):22.3閔清，白育庭，舒思潔，等.山楂葉總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注的保護(hù)作用J.中藥藥理與臨床，2005，21(2)：194范麗，郭巖，陳志武，等.黃蜀葵花總黃酮保護(hù)離體大鼠心肌缺血再灌注的研究J.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2003,19(2)：1915陳紅，章同華，蘇定馮.大鼠急性心肌梗塞及缺血/再灌注損傷模型J.第二