重組人粒細(xì)胞集落刺激因子成品蛋白質(zhì)含量測(cè)定及比活性分析

1、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF ）成品蛋白質(zhì)含量測(cè)定及比活性分析史新昌，劉蘭，陶磊，高凱，饒春明i（中國(guó)藥品生物制品檢定所，北京，100050）摘要目的：通過(guò)對(duì)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）樣品蛋白質(zhì)含量測(cè) 定及比活性分析，來(lái)評(píng)價(jià) rhG-CSF的質(zhì)量，為在rhG-CSF成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加 蛋白含量測(cè)定從而提高我國(guó)rhG-CSF的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。方法：通過(guò)從市場(chǎng) 和企業(yè)庫(kù)房中隨機(jī)抽樣的方式獲得供試品，應(yīng)用NFS-60細(xì)胞/MTT比色法檢測(cè)供試品的生物學(xué)活性；應(yīng)用 HPLC法檢測(cè)供試品的蛋白質(zhì)含量；然后計(jì)算供試品 中rhG-CSF的比活性（即生物學(xué)活性與蛋白質(zhì)含量之比）。

2、結(jié)果：本次供試品來(lái) 自北京、上海、浙江、福建等 7省市，共計(jì)18批次的樣品。按2005年版中國(guó) 藥典三部rhG-CSF NFS-60細(xì)胞/MTT比色法測(cè)定，18批供試品生物學(xué)活性平 均相對(duì)標(biāo)示量為115.5%。結(jié)果均符合規(guī)定，用新建立的HPLC法檢測(cè)樣品中蛋白含量，18批制品蛋白含量測(cè)定結(jié)果為標(biāo)示量的93%137%，平均值為標(biāo)示量的118.5%±13.6%。除有一批次樣品比活性低于該類制品原液藥典要求（應(yīng)不低 于6.0 >107 lU/mg）,其余17批供試品均符合其原液比活性要求，平均比活性為 7.5 >6 IU/mg,。結(jié)論：已上市rhG-CSF比活性總體情況較好，但

3、有個(gè)別批次 比活性可能存在問(wèn)題，為保證rhG-CSF質(zhì)量，有必要在其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加成品蛋白含量測(cè)定項(xiàng)目。關(guān)鍵詞：rhG-CSF，生物學(xué)活性，成品蛋白質(zhì)含量，比活性中圖分類號(hào)：文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：文章編號(hào)：Protein content determination and Specific Activity Analysis of RecombinantHuman G-CSF Final ProductsShi xin-cha ng, Liu Lan, Tao Lei, Rao Chun-min®（National Institute for the Control of Pharmaceut

4、ical and Biological Products, Beijing 100050,Chi na）Abstract: Objective To evaluate and an alysis the quality of recomb inant huma n G-CSF（rhG-CSF） final products , to debate the possibility to add the protein content in the rhG-CSF finalproduct requirement, and to debate the promotion of the nation

5、al rhG-CSF certeria . Method TherhG-CSF samples were from 7 provinces in China. Protein content of final product was1 通訊作者 E-mail: raocm 電話etermined by HPLC and the bioactivity was tested using NFS-60 cell proliferation/MTT method.The specific activities were the ratios of the bioactiv

6、ity results to the protein content results.Results Their bioactivity were all in compliance with the requirement of the China Pharmacopeia Vol. III （2005 edition）, and the mean labeled relative bioactivity was 115.5%. Their protein contents range was 93-137% of labeled, mean content was 118.5% 13.6%

7、. Conclusio±n The rhG-CSF final products were all in compliance with the requirements of the China Pharmacopeia Vol. III （2005 edition）. It showed that the rhG-CSF final products in China had generally high quality, but there was only one batch whose specific activity was a little lower than th

8、e bulk specific activity requirement of the ChP. So, it' s necessary to aidnd protein content testthe national rhG-CSF final product requirements.Key words: G-CSF, bioactivity, specific activity, protein contents重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）是一種刺激機(jī)體白細(xì)胞增殖的重組 蛋白類制品，主要用于治療放療、化療以及骨髓移植后中性粒細(xì)胞減少癥。 1991 年美國(guó) FDA

9、批準(zhǔn)重組人 G-CSF 上市，目前我國(guó)批準(zhǔn) 18 家制藥企業(yè)生產(chǎn) rhG-CSF， 批準(zhǔn)文號(hào)為69個(gè)，包括480他/支、300/支、200/支等10種規(guī)格，劑型包括 注射液和凍干注射劑兩種。目前，中國(guó)藥典 rhG-CSF 活性檢測(cè)方法為 NFS-60 細(xì) 胞增殖/MTT比色法，但缺少成品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法，主要原因是成品中保 護(hù)劑或賦性劑對(duì) lorry 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量存在一定干擾。因此，多年來(lái)一直未對(duì) 上市的 rhG-CSF 制品的比活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。隨著 HPLC 技術(shù)的發(fā)展，尤其是近年 rhG-CSF 蛋白質(zhì)含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的研制成功，使得對(duì) rhG-CSF 成品中蛋白質(zhì)含量 測(cè)定成為可能。

10、本文應(yīng)用最新研制成功的 rhG-CSF 蛋白質(zhì)含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，建 立了 HPLC 測(cè)定 G-CSF 蛋白含量新方法，經(jīng)驗(yàn)證后測(cè)定了從市場(chǎng)和企業(yè)庫(kù)房中 隨機(jī)抽樣的方式獲得的 18 批次供試品中 rhG-CSF 蛋白含量，并進(jìn)一步計(jì)算和分 析了該制品成品的比活性，為下一步 rhG-CSF 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高奠定了基礎(chǔ)。1儀器、試劑和藥品多功能酶標(biāo)儀 SpectraMax250（ Molecular Devices 公司）；普通離心機(jī) （Eppendorf 公司）；倒置顯微鏡（ Olympus 產(chǎn)品）；二氧化碳培養(yǎng)箱（ Thermo 公司）； 微量移液器 （Eppendorf 公司 ）。RPMI 164

11、0 培養(yǎng)基（ Sigma 公司）；新生牛血清（杭州四季青）； MTT （Sigma 公司）； NFS-60 細(xì)胞（本室保存）； rhG-CSF 效價(jià)測(cè)定用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（ 98/01）； rhG-CSF 同質(zhì)蛋白質(zhì)含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（ 270023-08/01）；碳酸氫鈉、氯化鈉、氯 化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸、 Triton X-100 、異丙醇等化學(xué)試劑均為 國(guó)產(chǎn)分析純（北京化工廠）。供試樣品來(lái)北京、上海、浙江、福建等 7 省的市場(chǎng)和企業(yè)成品庫(kù)房的隨機(jī)抽 樣，涉及11個(gè)企業(yè)，共18批產(chǎn)品，涉及規(guī)格有 750支、100 g/支、150/支、 200舊/支、300/支等。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 r

12、hG-CSF 生物學(xué)活性測(cè)定方法 （1） 參見(jiàn)中國(guó)藥典 2005 版三部 附錄 X E。2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定：色譜柱為 TSK G3000SWXL 凝膠色譜柱；流動(dòng)相為 pH4.0的20mmolL-1醋酸鹽-0.2mol L-1硫酸鈉緩沖液；流速為 1mLmin-1；色譜柱 溫度25芳C，樣品池溫度4i2C ；檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm；信號(hào)采集時(shí)間30min。將 rhG-CSF 同質(zhì)蛋白質(zhì)含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品定量稀釋為 21.54、 17.23、 12.92、8.62和4.31 ygL-1。用上述方法過(guò) SEC-HPLC，進(jìn)樣2次，每次50卩，積分求得 峰面積均值，并與蛋白濃度回歸求得標(biāo)準(zhǔn)直線。樣品經(jīng)

13、過(guò)適當(dāng)稀釋后，進(jìn)樣 2 次，每次50卩，積分求峰面積均值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)直線計(jì)算蛋白質(zhì)含量2。另外，取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液混勻，體積比1: 9,進(jìn)樣2次，每次50門用于計(jì)算各待測(cè)樣品的回收率。2.3 比活性計(jì)算 使用前兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算生物學(xué)活性與蛋白質(zhì)含量比值。3結(jié)果3.1 rhG-CSF 生物學(xué)活性測(cè)定結(jié)果 在本次所檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)表 1。 18 批次產(chǎn)品生物學(xué)活性均符合中國(guó)藥典三部rhG-CSF要求的 應(yīng)為標(biāo)示量的80%150%”。合格率為 100%，平均相對(duì)標(biāo)示量為 115.5%。3.2 蛋白質(zhì)含量結(jié)果分析 18 批制品蛋白含量測(cè)定結(jié)果為標(biāo)示量的 93%137%，其中 90%100%的有 3 個(gè)

14、批次， 100%110%有 1 個(gè)批次， 110%120%有 5 個(gè)批次，大于 120%有 9 個(gè)批次，平均值為標(biāo)示量的 118.5%±13.6%，回收率除一 批偏低外其余均在 90%以上。本次抽驗(yàn)制品的蛋白含量測(cè)定，未發(fā)現(xiàn)有蛋白含量 偏低的制品。3.3 rhG-CSF 比活性 除編號(hào) 1-1 的樣品比活性偏低外，其余 17 批次樣品 的比活性均符合中國(guó)藥典三部中該制品原液中對(duì)比活性的要求，每毫克應(yīng)不 低于6.0 X0 IU。全部批次比活性的值為：7 7.3-5 X0 ±.02 X0 IU? mg ;去 除偏低批次后，17批次比活性的值為：7.50 X07±).8

15、3 X07 IU? mg-i。表1、rhG-CSF生物學(xué)活性、蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果及比活性計(jì)算結(jié)果編號(hào)規(guī)格活性標(biāo)示量生物活性實(shí)際測(cè)量值蛋白含量實(shí)際測(cè)量值比活性(X10 lU/mg )(X10 iU/支)6X10 IU/ 支相對(duì)測(cè)定濃度標(biāo)示量（%）相對(duì)標(biāo)示（mg/mL量（%）回收率（%）1-1100 卩 g支, 0.45mL/支6.005.9899.70.2762120.8795.394.812-2150 卩 g/0.6mL支12.014.2118.30.2884115.36101.368.212-375 卩 g/0.3mL支6.007.18119.70.2870114.8097.958.343-

16、40.3mL : 75 yg4.506.19137.60.246398.5284.098.384-59000000IU(150 卩 g):0.9m支9.0012.5138.90.2194131.3893.796.335-675 卩 g支 ,1.0ml/ 支4.906.54133.50.078104.0097.818.386-775 卩 g支，0.5ml5.605.82103.90.139292.8090.658.367-8300 y g/1.8 X 10000000/1.0支_/18.022.1122.80.280993.6395.517.878-975 y g瓶,1.0mL/ 支5.957.

17、30122.70.0867116.6094.088.428-1075 y g瓶,1.0mL/ 支5.955.2588.20.0842112.2792.066.249-110.3mL : 75 yg6.756.7199.40.3142125.6891.857.129-120.6mL : 150 yg13.513.398.50.3192127.6899.576.9410-130.8mL : 16000000IU/200 y支/16.017.0106.30.2912116.4892.667.3010-141.8mL : 36000000IU/450y支/36.040.0111.10.3318132.

18、7298.406.7010-150.6mL : 12000000IU/150y支/12.012.0100.00.3298131.9294.936.0610-160.6mL : 12000000IU/150y支/12.015.2126.70.3390135.6098.727.4711-17100 yg( 800 萬(wàn) IU) / 支,0.67mL/ 支8.0010.1126.30.1883126.3891.938.0111-18150 yg( 1200 萬(wàn) IU ) /支,1.0mL/支1.2015.0125.00.2051136.7394.297.314討論本次樣品涉及北京、河北、山東、江蘇、上海、浙江、福建 7 省，生產(chǎn)廠家