體內(nèi)烏頭類生物堿毒物檢測方法概述

1、體內(nèi)烏頭類生物堿毒物檢測方法概述         08-05-22 15:37:00     作者：張帆    編輯：studa20【摘要】  概述了利用薄層層析法、紫外分光光度法、高效液相色譜法、高效液相質(zhì)譜聯(lián)用、多級質(zhì)譜等方法檢測體內(nèi)烏頭類生物堿毒物的方法，旨在為臨床診斷和鑒定提供有益的借鑒。 【關(guān)鍵詞】  烏頭； 生物堿； 毒物檢測； 高效液相色譜法    烏頭類生物堿是一類化學結(jié)

2、構(gòu)復(fù)雜和生物活性較強的中藥成分，絕大部分存在于烏頭屬（Aconitum）和翠雀屬（Delphinium）植物中。烏頭屬植物在我國有170余種，資源十分豐富，其中有的為常用中藥材，如川烏、草烏、附子等，可用于鎮(zhèn)痛、麻醉、消炎和治療風濕等疾病，功效顯著1。烏頭類生物堿被認為是這些藥材的特征生物活性成分，但大多數(shù)烏頭屬藥材都含有大量的有毒雙酯型烏頭堿2。常見的這類雙酯型生物堿的結(jié)構(gòu)見圖1，其中烏頭堿為此類藥材中廣泛存在且含量較高的一種。    由于炮制、誤服或投毒等原因而引起烏頭堿中毒的情況很多，口服烏頭堿0.2 mg即可引起中毒，致死量為25 mg3，治療量與中毒量或

3、致死量接近4。僅1980年以來在國內(nèi)報道的懷疑是烏頭堿中毒的案例達數(shù)萬宗，并有大量中毒案例未予報道5。這些案例涉及中毒的臨床鑒定，鑒定的目的是判定其攝入量是否超出治療量范圍，而這個過程的關(guān)鍵是要準確地檢測出體內(nèi)烏頭類生物堿的殘留量。由于烏頭堿在體內(nèi)分解代謝迅速(半衰期t1/2為2 min)，而且烏頭堿中毒亦無特異性臨床表現(xiàn)，中毒劑量也因個體差異有很大的不同，臨床診斷往往缺少科學依據(jù)。近年來由于科技的進步，為體內(nèi)烏頭堿毒物的檢測提供了新方法和新技術(shù)。本文概述了檢測體內(nèi)烏頭類生物堿毒物的方法，為臨床診斷和鑒定提供有益的借鑒。1  傳統(tǒng)方法    20世紀80

4、年代以前對烏頭類生物堿的檢測方法，已報道的有浸漬紙色譜法6、氣相色譜法7、薄層掃描法8、微量結(jié)晶法9、薄層層析法9、比色法9、紫外分光光度法9和紅外光譜法9等，這些方法或者分離不完全，測量誤差大，或者靈敏度不高，操作繁瑣，或者樣品需要量大，預(yù)處理繁瑣。    1985年，王月娥等10就利用放射性標記法、藥代動力學模型和紙層析分析法詳細研究過3-乙酰烏頭堿在小鼠體內(nèi)的代謝過程，并獲得了幾個結(jié)果。血藥濃度：利用動力學模型算出了該化合物在體內(nèi)的藥代動力學參數(shù)。組織含量：在注射5 min后膽囊中3-乙酰烏頭堿含量最高，之后依次是肝、腎、肺和脾，心臟和腦最低；3 h后膽囊中

5、含量明顯升高，約為5 min時含量的2.3倍；24 h后膽囊含量明顯降低，而其它組織中含量降低不明顯。給藥5 d后各組織中仍有一定量，直至7 d后臟器中含量才接近衡量。排泄?jié)舛龋簩π∈蠼o藥30 min后尿內(nèi)已有生物堿排出，12 h和24 h后尿內(nèi)生物堿排出量分別為（22±5）和（27±4），3-乙酰烏頭堿原型排出量分別為（5.2±1.0）和（6.2±10）。與血漿蛋白的結(jié)合：結(jié)果表明3-乙酰烏頭堿與血漿蛋白的結(jié)合率為（28.5±2.5）。代謝：3-乙酰烏頭堿進入體內(nèi)后發(fā)生代謝分解，以多種形式存在，有3-乙酰烏頭堿原型物、烏頭堿和其它烏頭類生物堿

6、，表明其進入體內(nèi)后并非立即發(fā)生全部3位脫乙?；D(zhuǎn)化為烏頭堿。以上結(jié)論雖然僅針對3-乙酰烏頭堿的代謝，但提供了研究烏頭生物堿在體內(nèi)代謝過程和定性分析毒物種類，以及從體內(nèi)代謝物中分析中毒原因提供了重要思路。但該方法繁瑣費時，靈敏度不高而難于推廣。    李緒文等11從已灌服烏頭堿3 h后的家兔膽汁中提取出代謝物，在薄層色譜（TLC）上快速地展開用碘化鉍鉀溶液顯色，進行了初步快速研究。實驗表明：采用的烏頭總堿的提取方法以及TLC檢識條件均可用于烏頭堿在動物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的研究，可為因服用烏頭堿類藥物而導致中毒的法醫(yī)學快速鑒定提供依據(jù)和方法。給藥3 h后，烏頭堿在兔體內(nèi)的代

7、謝產(chǎn)物大量集中在肝臟而不是膽汁中，因此毒物的檢測應(yīng)重點在肝臟。2  高效液相色譜法（HPLC）    高效液相色譜法是20世紀60年代末迅速發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，分離效能高、分析速度快、檢測靈敏度高，對藥物動力學和臨床藥學研究的重要性越來越突出。    王慕鄒等12在1983年就較早地利用HPLC測定了10種烏頭植物中的烏頭堿、中烏堿和次烏堿的含量。發(fā)現(xiàn)雖然烏頭類生物堿的最大吸收為230 nm左右，但在該波長雜質(zhì)干擾大，而在240 nm檢測基線更穩(wěn)定，可分析各種烏頭中的生物堿含量，為檢測烏頭類生物堿提供了可行的方法

8、。    張興華等13初步探索應(yīng)用HPLC以甲醇0.01 mol/L碳酸銨水溶液二氯甲烷（90102）為流動相，在ODS反相色譜柱上，以丁卡因為內(nèi)標，波長為235 nm的紫外光，檢測了烏頭堿注射入家兔靜脈后血液中的濃度情況，給出了從血液中定量分析烏頭堿的方法。實驗所用乙醚作溶劑來提取血液中烏頭堿具有雜質(zhì)少、毒性小和便于操作等優(yōu)點；采用丁卡因作內(nèi)標較諸文獻12能更好地消除處理過程及色譜檢驗過程中的誤差，提高測定的準確性；采用以無機銨鹽作為改性劑的流動相較文獻12，14中采用有機胺具有毒性低和堿性小的特點，對色譜柱損害小。    在對生物

9、堿高烏甲素的藥理活性和毒性已有報道，而其代謝產(chǎn)物不明的情況下，Xie FM等15針對高烏甲素研究了其在小鼠體內(nèi)的代謝過程和產(chǎn)物。作者采用分離效率高的HPLC分離小鼠尿液中的代謝產(chǎn)物，然后用靈敏度高、選擇性強的電化學檢測器檢測各個化合物，再與標準品對照，檢測到了此化合物原型和它的4個代謝產(chǎn)物，為針對檢測化合物高烏甲素的中毒提供了依據(jù)。    武紅喜等16在實際中毒案例中，應(yīng)用HPLC選擇了理想的流動相和色譜柱，結(jié)合薄層層析和紫外光譜分析，成功地檢出了烏頭堿成分，烏頭堿紫外吸收在234 nm處有最大吸收。并將其成功地運用到實際中毒案例中，通過對死者的檢驗發(fā)現(xiàn)烏頭堿成分

10、已經(jīng)達到致死量，確定了中毒原因。該方法不足在于靈敏度低，檢出限較高。    1996年Yoshioka N等17較系統(tǒng)地報道了一例因誤食烏頭堿而中毒死亡的例子。他們在其死亡24 h后用Gas Chromatography/Selected Ion Monitoring（GC/SIM）方法分析了病人血清和尿液中的烏頭堿含量。結(jié)果在血清中僅發(fā)現(xiàn)微量的Jesaconitine，而無烏頭堿、中烏堿和次烏堿，這可能與死亡時間過長有關(guān)。相反在尿液中清晰地檢測到了烏頭堿及其代謝物中烏堿、次烏堿和Jesaconitine，18 h后的生物堿濃度遠低于13 h后的濃度，說明這段時間

11、內(nèi)生物堿吸收、代謝和排泄相對較快。GC/SIM方法對體液特別是對血液中生物堿檢測的應(yīng)用，說明該方法對臨床上鑒定中毒者是否因烏頭堿中毒的死因具有實用意義和借鑒意義。同時這種靈敏的方法同樣可應(yīng)用于烏頭生物堿的吸收、分布和代謝等基礎(chǔ)性研究。3  高效液相質(zhì)譜（HPLC-MS）、高效液相多級質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MSn）    由于GC/MS方法需要繁瑣的提取和化合物衍生化過程，Ohta H等18首次選擇已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物領(lǐng)域的HPLC，結(jié)合紫外吸收檢測、固相提取和快原子轟擊質(zhì)譜方法研究了烏頭堿中毒者血液和尿液化學成分。即用液相色譜/快原子轟擊質(zhì)譜法（HPLC/F

12、AB-MS）從血液中檢測到了4種有毒烏頭類化合物，即烏頭堿、中烏堿、次烏堿和Jesaconitine，洗脫劑采用優(yōu)化后的四氫呋喃0.2三氟乙酸體系（1486，V/V），為判斷是否烏頭堿中毒提供了依據(jù)。作者考慮到這些生物堿結(jié)構(gòu)中均含有酯鍵，為了在HPLC/FAB-MS過程中選擇合適的溶劑溶解標準品，專門研究了它們在不同溶劑中的穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)這些生物堿在堿性溶液中水解最快，在甲醇和乙醇中不穩(wěn)定，在乙氰、四氫呋喃和稀鹽酸中最穩(wěn)定（表1），因此可以用這些穩(wěn)定的溶劑溶解樣品。文獻18中提到血液中生物堿的致死濃度為100470 ng/ml，而應(yīng)用HPLC/FAB-MS和固相提取相結(jié)合方法的檢測限能達到50 ng/ml，因此即使有其它成分干擾，也能從血液和尿液中檢測到毒物的濃度。以上這些結(jié)論對于準確檢測生物堿種類和判斷中毒原因具有重要意義。    Xie FM, Zhang HG等15，1921利用多級質(zhì)譜可以根據(jù)裂解碎片和