三乙烯四胺對c-MYC啟動子的調(diào)節(jié)作用

1、三乙烯四胺對c-MYC啟動子的調(diào)節(jié)作用鄧小紅 劉建輝* 鄭旭煦 陳剛 郭麗霞(重慶工商大學(xué)藥物化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)研究中心，重慶，400067)摘要 目的 探討三乙烯四胺 (triethylene tetramine, TETA)對c-MYC啟動子的調(diào)節(jié)作用。方法 構(gòu)建c-MYC啟動子的熒光報告質(zhì)粒及其突變體，經(jīng)過序列測定后，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞24 h后，以終濃度為0 mmol/L, 0.1 mmol/L, 1.0 mmol/L, 10 mmol/L, 100 mmol/L的TETA處理，測定其啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，計算TETA對其轉(zhuǎn)錄活性抑制率。結(jié)果 成功構(gòu)建c-MYC啟動子熒光報告質(zhì)粒PGL3-

2、Basic/c-MYC NHE III1 promoter及其突變體pGL3-Basci/c-MYC NHEIII1 promoter mutant。將二者分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，TETA可以劑量依賴的抑制c-MYC啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，而對突變體的轉(zhuǎn)錄活性抑制作用明顯下降。結(jié)論 TETA能通過c-MYC啟動子上的超敏元件對其轉(zhuǎn)錄活性具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。關(guān)鍵詞： TETA；c-MYC啟動子；G四鏈體；轉(zhuǎn)錄活性基金項目：國家自然基金(30600813, 30701020)、教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計劃 （NCET-07-0913）以及重慶市科委重點基礎(chǔ)項目（CSTC, 2005BA5023）的資助。作者簡介:鄧

3、小紅，女，在讀博士*通訊作者: 劉建輝，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師Tel: (023) 62769652Email: jhliuTETA regulates the transcription of c-MYC promoter by enhancing the stability of G-quadruplexDENG Xiao-hong, LIU Jian-hui*, ZHENG Xu-xu, CHEN Gang, GUO Li-xia(Research Center of Pharmaceutical Chemistry & Chemical Biology, Chongqing

4、Technology and Business University, Chongqing, 400067, China)ABSTRACT: OBJECTIVE To study the effect of triethylene tetramine (TETA) on the transcription of c-MYC promoter. METHODS After the wild and mutant reporter gene plasmids containing the c-MYC NHE III1 sequence were constructed, the two plasm

5、id were transfected into HEK 293 cells. The transfected cells were replated into 96 wells plate, and treated with different concentrations of TETA (0.0 mmol/L, 0.1 mmol/L, 1 mmol/L, 10 mmol/L, 100 mmol/L) for about 6-8h, the luciferase activity was determined with its substrate BrightGlo. The inhibi

6、ting rate of TETA on the reporter gene were calculated by the luciferase activity. RESULTS The luciferase report gene plasmids including pGL3-Basic/c-MYC NHE III1 promoter and its mutant were constructed successfully. And TETA could inhibit the transcription activity of wild reporter gene in a dose-

7、dependent manner, but for the mutated gene, the inhibiting rate was decreased significantly. CONCLUSION TTETA has negative regulatory effect on c-MYC promoter through nuclease hypersensitive element III1. Key words: Triethylene tetramine；c-MYC promoter；G-quadruplex；transcriptionc-MYC是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種生

8、理功能，如在G1/S的過渡、G2/M的轉(zhuǎn)化中都有作用，與細(xì)胞的生長、增殖、分化密切相關(guān)。它同時也是一種重要的原癌基因，位于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多種信號通路的關(guān)鍵交匯點，其蛋白的表達(dá)失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)1,2，過量表達(dá)將直接或間接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。研究表明，c-MYC基因的轉(zhuǎn)錄85-90是由其啟動子區(qū)的核酸超敏元件III1 (nuclease hypersensitive element III1, NHE III1)所控制3。該元件即為G4-DNA結(jié)構(gòu)，一段富含鳥嘌呤的重復(fù)序列，該序列在一定條件下可以形成四鏈螺旋結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)在端粒、免疫球蛋白開關(guān)區(qū)、基因啟動子區(qū)等許多具有重要生物學(xué)功能的基

9、因組中出現(xiàn)。目前已有多種小分子化合物顯示出對G4-DNA的穩(wěn)定作用，其中包括酰胺蒽醌類化合物4-7、卟啉類化合物等8-10。TETA是一種小分子化合物，在中性溶液中帶正電，類似于K，我們前期通過圓二色譜以及熱力曲線證明，TETA在體外能夠增強(qiáng)人端粒DNA和c-MYC NHE III1啟動子序列形成的G4-DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性11, 15本文將研究TETA在細(xì)胞內(nèi)對c-MYC啟動子的調(diào)節(jié)作用，為TETA的抗腫瘤作用機(jī)制提供實驗依據(jù)。1. 實驗材料藥品和試劑c-MYC啟動子質(zhì)粒Pbv-Del1由美國哈佛醫(yī)學(xué)院Dr. Bert Vogelstein惠贈，限制性內(nèi)切酶Nhe I和EcoR V購自于TaK

10、aRa公司，c-MYC啟動子突變體引物由上海生工合成，突變試劑盒購自于Stratagene公司，Bright- GloTM熒光試劑購自Promega公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。HEK293細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海生化細(xì)胞所。細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM、胎牛血清均購自Hyclone公司，TETA購自于Aldrich公司。2. 方法2.1 c-MYC啟動子熒光報告質(zhì)粒的構(gòu)建將Pbv-Del 1和PGL3-Basic兩種質(zhì)粒分別都用Nhe I和EcoR V進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳后，切膠回收c-MYC啟動子2500 bp的片斷和酶切后的PGL3-Basic質(zhì)

11、粒。將此兩種酶切后回收產(chǎn)物按1:5比例在4下連接過夜，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5中。37過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌，并提取其質(zhì)粒后，用Nhe I和EcoR V進(jìn)行酶切鑒定，將鑒定結(jié)果為陽性的質(zhì)粒命名為PGL3-Basic/c-MYC promoter。2.2 c-MYC啟動子突變體的構(gòu)建根據(jù)Gene Bank登錄號：AC103819 gi:22539123中的c-MYC啟動子序列，設(shè)計突變引物為，上游: ATGGGGAGGGTGAGGAGGGTGGGGAAGGTGGGG，下游:TTCCCCACCCTCCTCACCCTCCCCATAAGCGCC。根據(jù)Stratagene的突變試劑盒說明，首先以

12、PGL3-Basci/c-MYC promoter質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將Dpn I酶加入到擴(kuò)增產(chǎn)物中，37作用1 h后直接轉(zhuǎn)化到XL-bule菌，涂板。37過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌，提取質(zhì)粒后，用Nhe I和EcoR V進(jìn)行酶切鑒定，將鑒定結(jié)果為陽性的質(zhì)粒送TaKaRa公司測序，將突變成功的質(zhì)粒命名為PGL3-Basci/c-MYC promoter mutant。2.3 TETA對c-MYC啟動子的調(diào)節(jié)作用腫瘤細(xì)胞HEK293以1×105/mL接種于6孔板中，待其融合度達(dá)到6580時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。提取的PGL3-Basic/c-MYC promoter和PGL3-Basic/c-

13、MYC promoter mutant兩種質(zhì)粒分別調(diào)其濃度為0.5 mg/mL。將此兩種質(zhì)粒分別與脂質(zhì)體Lipofectamine 2000混合均勻后，轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞中，置37，5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別以1×106/mL濃度接種于96孔板，100 mL/孔。待細(xì)胞貼壁后，約2 h4 h，加入稀釋的TETA，使其終濃度分別為：0 mmol/L , 0.1 mmol/L, 1.0 mmol/L, 10 mmol/L, 100 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6-8 h后，Veritas TURNER BIOSYSTEMS上測定細(xì)胞的熒光值。將TETA濃度為0的組設(shè)定為contr

14、ol(A)，同批測定其它組的值(X)計算抑制率(I），抑制率(I)(AX）/A×100，統(tǒng)計分析，采用origin 7.5軟件進(jìn)行。3. 結(jié)果3.1 c-MYC啟動子熒光報告質(zhì)粒的構(gòu)建從Pbv-Del 1質(zhì)粒上酶切下了c-MYC啟動子的全片斷，并將其與PGL3-Basic質(zhì)粒連接。經(jīng)過對單克隆菌株質(zhì)粒的酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)從PGL3-Basic酶切下大小為2500 bp的DNA 片斷，連接成功的質(zhì)?？偞笮?300 bp左右，從而構(gòu)建了c-MYC啟片動子熒光報告質(zhì)粒PGL3- Basic /c-MYC promoter (Fig.1, Fig. 2）。圖1. c-Myc基因結(jié)構(gòu)Fig 1.

15、Structure of c-MYC gene圖2. pGL3- Basic /c-myc promoter的酶切鑒定Fig. 2 Identifiction of pGL3- Basic /c-Myc promoter digested with NheI and EcoRVLane 1: DNA marker DL15000; Lane 2: PGL3- Basic /c-myc promoter plasmid; Lane3,4: PGL3- Basic /c-myc promoter plasmid digest by Nhe Iand EcoR VLane 5: DNA marker

16、 DL20003.2 c-MYC啟動子突變體的構(gòu)建以pGL3- Basic /c-MYC promoter為模板進(jìn)行PCR定點突變，擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL-bule z 菌，挑取到含有PGL3- Basic /c-MYC promoter突變位點的質(zhì)粒，經(jīng)過測序，發(fā)現(xiàn)c-MYC啟動子NHEIII1的G12A突變成功 (Fig. 3)，由此獲得了pGL3-Basci/c-MYC promoter mutant。 A B圖3. PGL3-Basci/c-myc promoter mutant質(zhì)粒的酶切鑒定和測序結(jié)果Fig3.Identification of PGL3-Basci/c-Myc promo

17、ter mutant digested with Nhe I and EcoR V (A) and the sequence report (B)3.3 TETA對c-MYC啟動子的調(diào)節(jié)作用為了考察TETA對c-MYC NHE III1啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響，我們分別用不同濃度的TETA處理轉(zhuǎn)染了野生型和突變型報告基因質(zhì)粒的293細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，加入TETA的細(xì)胞孔的熒光值明顯下降；100 µM TETA作用8小時對報告基因的轉(zhuǎn)錄抑制率可以達(dá)到66.2%，即使TETA濃度低至nM水平，也有明顯的抑制作用，0.1µM TETA作用8小時對報告基因的抑制率為30.4

18、%。但是，當(dāng)我們對c-MYC NHE III1啟動子形成G四鏈體的關(guān)鍵核苷酸突變之后，TETA的這種抑制作用明顯下降，0.1和100 µM TETA作用8小時的抑制率分別為4.3%和25.7%，表明TETA對c-MYC NHE III1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用與其穩(wěn)定該序列形成的G四鏈體結(jié)構(gòu)有關(guān)。實驗結(jié)果如圖4 所示。圖4. TETA對c-MYC啟動子轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用 Fig4. Triethylene tetramine inhibits the transcripting activity of c-MYC promoter NHE III1. After the HEK29

19、3 cells were transfected with plasmid of wild and mutanted c-MYC NHE III1 promoter for 24 h, the cells were replated in 96 well plate, after the cells attached, indicated concentrations of TETA were added, and continue to incubate for 6-8 h, after that, the luciferase activities were detected with i

20、ts substrate (Brightglo). All the data are shown as mean ± SD from three independent experiments. *， p<0.01 Vs control.4討論c-MYC與腫瘤有著密切的聯(lián)系，其蛋白的過表達(dá)將直接或間接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，而c-MYC蛋白的表達(dá)水平最主要取決于其啟動子的轉(zhuǎn)錄活性高低。c-MYC的啟動子屬于內(nèi)啟動，包含在外顯子1中。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，c-MYC啟動子中存在一段富含鳥嘌呤的重復(fù)序列，即G4-DNA結(jié)構(gòu)，其主要控制著該蛋白的轉(zhuǎn)錄。實驗證實，K+離子存在時，NHE III1區(qū)堿基能

21、夠形成4種平行結(jié)構(gòu)的G4-DNA 12,13。當(dāng)能夠提高G4-DNA穩(wěn)定的陽離子卟啉化合物TMPyP4作用與腫瘤細(xì)胞時，細(xì)胞中c-MYC mRNA及蛋白水平均被下調(diào)；與之相對應(yīng)當(dāng)NHE III1區(qū)的DNA序列發(fā)生GA突變時，G4-DNA的穩(wěn)定性降低，c-MYC啟動子的轉(zhuǎn)錄活性能提高3倍14。Lemarteleur等發(fā)現(xiàn)三嗪衍生物9944，陽離子卟啉化合物TMPyP4等多種已報道的通過G4-DNA能夠有效的穩(wěn)定c-MYC啟動子NHE III1區(qū)形成G4-DNA結(jié)構(gòu)，并有可能在腫瘤細(xì)胞中抑制c-MYC基因的轉(zhuǎn)錄，從而有可能阻止腫瘤細(xì)胞周期的進(jìn)程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，TETA能穩(wěn)定人端粒DNA以及c-

22、MYC NHE III1形成的G四鏈體DNA結(jié)構(gòu),并能抑制c-MYC基因的表達(dá)15。但是，我們還沒有獲得TETA抑制c-MYC表達(dá)的直接證據(jù)。本文中，我們通過基因定點突變技術(shù)，利用報告基因法對TETA調(diào)節(jié)c-MYC NHE III1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行了分析，實驗結(jié)果表明，TETA可能通過c-MYC啟動子的G4-DNA結(jié)構(gòu)對其啟動子的轉(zhuǎn)錄活性具有調(diào)節(jié)作用。本實驗構(gòu)建了c-MYC全長啟動子的熒光報告質(zhì)粒PGL3-Basic/c-MYC NHEIII1 promoter，其中包含其P1和P2啟動子 (圖1)。以此質(zhì)粒為模板，在其啟動子的G4-DNA區(qū)域內(nèi)設(shè)計一突變位點，將G12突變?yōu)锳，以破壞其結(jié)

23、構(gòu)，從而改變啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。由于該突變位點位于富含GC區(qū)，因此采用QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)試劑盒進(jìn)行突變，以保證突變成功。經(jīng)過生物公司測序，我們成功獲得突變體質(zhì)粒PGL3-Basci/c-MYC promoter mutant。將此兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入TETA作用后，野生型啟動子的轉(zhuǎn)錄活性明顯下降，且呈劑量依賴關(guān)系，但對突變體，這種抑制作用明顯下降，提示TETA抑制c-MYC基因表達(dá)可能與其在體內(nèi)能與c-MYC啟動子的超敏元件相互作用，增加G4-DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)。大量的研

24、究結(jié)果證實，c-MYC NHE III1 形成的G4-DNA在不同條件下有不同的結(jié)構(gòu) (圖5)，主要包括籃式結(jié)構(gòu)和椅式結(jié)構(gòu)16。該突變位點為G12，處于形成G四鏈體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵位置，當(dāng)其被突變以后，造成其G四鏈體結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，使得G4-DNA松散，從而可能增加了啟動子與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子作用的機(jī)會或增加了轉(zhuǎn)錄酶通過該區(qū)域的機(jī)會，從而增加了其轉(zhuǎn)錄活性。我們也同時發(fā)現(xiàn)，高濃度的TETA對突變型的c-MYC NHE III1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性仍有一定的抑制作用，這可能是由于其單一位突變不能完全破壞其高級結(jié)構(gòu)，仍能在一定程度上形成G-四鏈體DNA結(jié)構(gòu)。 圖5. 突變位點在G4-DNA結(jié)構(gòu)的示意 (Abstrac

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