急性早幼粒細(xì)胞白血病發(fā)病及誘導(dǎo)分化機(jī)制研究進(jìn)展(陳竺)

1、急性早幼粒細(xì)胞白血病發(fā)病及誘導(dǎo)分化機(jī)制研究進(jìn)展中華血液學(xué)雜志CHINESE JOURNAL OF HEMATOLOGY劉廷析茅矛陳竺王振義關(guān)鍵詞：急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL） 誘導(dǎo)分化 治療急性早幼粒細(xì)胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是臨床上第一個(gè)應(yīng)用誘導(dǎo)分化治療取得成功和第一種針對(duì)腫瘤特異性標(biāo)志分子進(jìn)行治療的人類惡性腫瘤。95%以上APL患者具有特征性的非隨機(jī)染色體t（15；17）。該易位使15號(hào)染色體上的早幼粒細(xì)胞白血?。≒ML）基因與17號(hào)染色體上的維甲酸受體（RAR）基因發(fā)生融合，表達(dá)PML-RAR融合蛋白1。少數(shù)變異型APL患者產(chǎn)生t（1

2、1；17），該易位使11號(hào)染色體上的早幼粒細(xì)胞白血病鋅指（PLZF）基因與17號(hào)染色體上同樣的RAR基因發(fā)生融合，表達(dá)為PLZF-RAR融合蛋白2。在APL發(fā)病機(jī)制中，應(yīng)注意此兩種融合蛋白分別與野生型PML或PLZF、RAR蛋白共存于APL細(xì)胞中。研究表明，PML-RAR或PLZF-RAR融合蛋白可顯性失活（dominant negative）野生型PML或PLZF蛋白的功能和干擾正常RAR信號(hào)傳導(dǎo)，因而研究融合蛋白如何影響PML蛋白正常功能及RAR信號(hào)傳遞成為理解APL發(fā)病及誘導(dǎo)分化機(jī)制的關(guān)鍵。1PML蛋白的正常功能及融合蛋白對(duì)PML蛋白功能的影響早期體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，PML具有增殖抑制活性

3、3。Wang等4以敲除（knockout）PML基因小鼠作為體內(nèi)研究模型，發(fā)現(xiàn)純合缺失PML鼠(缺失兩個(gè)PML基因)有如下特征：外周血成熟粒細(xì)胞（中性、嗜酸、嗜堿、單核）顯著低于正常鼠；骨髓、肝、脾、淋巴結(jié)成熟粒細(xì)胞顯著減少；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embyonic fibroblast, MEF)增殖率和3H-TdR摻入率顯著高于正常鼠，而雜合缺失(僅缺失一個(gè)PML基因)PML鼠居中；MEF克隆形成能力增強(qiáng)，S期細(xì)胞顯著增多，G0或G1期細(xì)胞顯著減少；在誘變劑DMBA和TPA作用下，純合缺失PML鼠皮膚發(fā)生更多的乳頭狀瘤。研究表明，PML蛋白抑制增殖的機(jī)制是通過(guò)阻滯細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的。將

4、PML基因轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，Le等5發(fā)現(xiàn)cyclin D1、CDK2表達(dá)顯著下調(diào)，P53、P21WAF1/CIP1表達(dá)上升，Rb蛋白去磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞阻滯在G1期。Wang等4進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)維甲酸(RA)信號(hào)通路可能需要PML蛋白的增殖抑制活性。在甲基纖維素培養(yǎng)體系中，正常鼠的造血前體細(xì)胞形成紅系、髓系集落的數(shù)量在加入RA后明顯增加，但純合缺失PML鼠則無(wú)此效應(yīng)。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)1 mol/L RA可誘導(dǎo)正常MEF細(xì)胞表達(dá)P21WAF1/CIP1，而缺失PML的MEF細(xì)胞則無(wú)，說(shuō)明PML介導(dǎo)RA依賴的P21WAF1/CIP1表達(dá)。由于P21WAF1/CIP1能誘導(dǎo)造血細(xì)胞分化6，因而PML的功能缺失可

5、解釋APL情況下的分化阻滯。上述結(jié)果表明，PML蛋白至少部分地參與RAR/RXR信號(hào)傳遞。PML蛋白的功能發(fā)揮與它在細(xì)胞內(nèi)的定位密切相關(guān)。在正常細(xì)胞，PML蛋白以不連續(xù)點(diǎn)狀方式（speckled pattern，punctate pattern）分布在細(xì)胞核內(nèi)，電鏡下呈0.30.5 m直徑，且與核基質(zhì)相關(guān)的致密圈餅樣結(jié)構(gòu)結(jié)合稱為核體（Nuclear bodies, NB）或POD（PML Oncogenic Domain）結(jié)構(gòu)，正常細(xì)胞核約含1030個(gè)7。POD結(jié)構(gòu)實(shí)質(zhì)上為多蛋白復(fù)合體，除PML蛋白外，尚含SUMO-18、pRb9、SP10010、rfp11、NDP55、ISG-20等蛋白成分

6、。其中一些是自身免疫性疾病如原發(fā)性膽汁性肝硬化患者的核抗原7。應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)，最近發(fā)現(xiàn)POD結(jié)構(gòu)的另一個(gè)新成員是SUMO-1（Small 1 Ubiquitin-Mediated Protein）8。SUMO-1屬泛素相關(guān)蛋白Sentrin家族成員。實(shí)驗(yàn)證明SUMO-1參與PML基因的翻譯后修飾過(guò)程，并因此介導(dǎo)PML蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位8,12,主要依據(jù)有：在表達(dá)PML蛋白的Hela細(xì)胞和COS細(xì)胞，免疫沉淀試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SUMO-1與PML蛋白形成共價(jià)復(fù)合物，該結(jié)合是可逆的，且依賴磷酸化發(fā)生；采用免疫熒光雙標(biāo)記發(fā)現(xiàn)幾乎所有POD結(jié)構(gòu)內(nèi)均含有SUMO-1蛋白和PML蛋白；在非APL細(xì)胞，未經(jīng)SUMO

7、-1修飾的PML蛋白彌散分布于核基質(zhì)中，而被SUMO-1修飾的則定位于POD結(jié)構(gòu)。用As2O3處理PML細(xì)胞4小時(shí)后彌散性熒光完全消失，代之以POD結(jié)構(gòu)增多、擴(kuò)大，提示As2O3能使彌散性分布的SUMO-1和PML共定位于POD結(jié)構(gòu)中8。NB4細(xì)胞（含PML-RAR）經(jīng)RA和As2O3各處理24小時(shí)、2小時(shí)后，Western blotting顯示PML-RAR融合蛋白完全降解， POD結(jié)構(gòu)的正常定位分別于2448小時(shí)、36小時(shí)完全恢復(fù)，該時(shí)相特點(diǎn)提示：RA和As2O3通過(guò)降解PML-RAR釋放被“扣押”的PML，繼而被SUMO-1修飾再回到POD結(jié)構(gòu)中。值得注意的是，PML-RAR也能與SUM

8、O-1形成復(fù)合物，但與PML不同，SUMO-1化的PML-RAR被迅速降解，降解機(jī)制不清8。Kamitani等12認(rèn)為，PML-RAR（長(zhǎng)型、短型）均不能被SUMO-1修飾，因而不參與PML-RAR的降解。最近，利用減數(shù)文庫(kù)技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)在NB4細(xì)胞中SUMO-1可被1 mol/L RA上調(diào)，支持SUMO-1參與PML-RAR降解及POD結(jié)構(gòu)恢復(fù)這一推測(cè)。目前，尚不清楚As2O3是否調(diào)控SUMO-1表達(dá)。POD結(jié)構(gòu)中另一重要成員是低磷酸化的pRb蛋白，是第一個(gè)被認(rèn)識(shí)的腫瘤抑制基因，通過(guò)“扣押”一組E2F轉(zhuǎn)錄因子而控制細(xì)胞周期G1-S轉(zhuǎn)換。pRb亞細(xì)胞定位類似于PML，即呈彌散和顆粒狀（POD樣

9、結(jié)構(gòu)）分布，這一特點(diǎn)促使Alcalay等10研究二者的可能結(jié)構(gòu)和功能聯(lián)系。應(yīng)用免疫沉淀及免疫雙重?zé)晒獐B加(Superimposition)實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)：在體外，PML與pRb形成復(fù)合物，出現(xiàn)共沉淀；以野生型pRb和PML基因轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞，80%以上含PML的POD結(jié)構(gòu)與pRb定位在同一部位，而pRb家族其他成員（如P107、P103）則無(wú)此現(xiàn)象；在NB4細(xì)胞，盡管POD結(jié)構(gòu)解體，但PMLpRb仍共同定位于APL細(xì)胞特有的異常微顆粒樣（microspeckles）結(jié)構(gòu)中。進(jìn)一步使用不同的缺失突變體，發(fā)現(xiàn)pRb“袋區(qū)”（pocket region）中703737氨基酸為結(jié)合所必需（該區(qū)也是E

10、2F轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位），而PML中多個(gè)結(jié)構(gòu)域參與結(jié)合，其中N-末端B盒和C-末端為結(jié)合所必需，環(huán)指（ring finger）、Coiled-coil區(qū)進(jìn)一步加強(qiáng)結(jié)合。由于PML-RAR也能有效地結(jié)合pRb，但缺乏不同長(zhǎng)度的C-末端區(qū)，推測(cè)尚存在其他結(jié)合方式。功能上PML-RAR可能通過(guò)影響pRb定位，干擾其增殖抑制功能而參與APL發(fā)生。最近發(fā)現(xiàn)，Sp100的另一個(gè)選擇性剪接成分Sp100-HMG也定位于POD結(jié)構(gòu)內(nèi)，Sp100是最早發(fā)現(xiàn)的POD結(jié)構(gòu)成員，而Sp100-HMG具有非序列特異的DNA結(jié)合能力，在被共轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞，Sp100、Sp100-HMG具有轉(zhuǎn)錄抑制活性，提示POD結(jié)構(gòu)

11、參與染色質(zhì)水平上的轉(zhuǎn)錄調(diào)控9。上述結(jié)果表明，作為功能性多蛋白復(fù)合體，POD結(jié)構(gòu)通過(guò)“扣留”多種重要的胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白而影響細(xì)胞基本的病理生理過(guò)程。不僅在APL，多種DNA病毒如單純皰疹病毒型、腺病毒E4等也影響POD結(jié)構(gòu)分布，用抗病毒藥物干擾素處理后，PML的表達(dá)及POD數(shù)量、大小增加13。Muller等8認(rèn)為正常細(xì)胞內(nèi)兩種形式的PML定位（彌散型和POD結(jié)構(gòu)）存在動(dòng)態(tài)平衡，POD結(jié)構(gòu)可能是PML以及其他重要功能蛋白的貯存形式，在PML-RAR以及病毒感染等因素影響下，POD結(jié)構(gòu)解體，其內(nèi)容物釋放，引起異常的細(xì)胞病理過(guò)程。2PML-RAR對(duì)RAR/RXR信號(hào)傳導(dǎo)的影響核激素受體RAR是配體依賴性的

12、轉(zhuǎn)錄激活因子。正常情況下，RAR功能的最佳發(fā)揮有賴于與另一類維甲酸受體RXR 形成異二聚體。在RA（配體）缺乏時(shí)，RAR/RXR異二聚體的轉(zhuǎn)錄靜默效應(yīng)通過(guò)與一組輔助抑制因子（corepressors）,如SMRT(silencing mediator for retinoid and thyroid-hormone receptors)、N-coR(nuclear receptor corepressor)、mSin3形成復(fù)合物，再募集(recruit)組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)，后者使核小體組蛋白 (H2,H3,H4) 氨基-末端賴氨酸殘基去乙?；?/p>

13、而帶正電，并與帶負(fù)電的DNA 結(jié)合，保持染色體的致密卷曲結(jié)構(gòu)從而抑制轉(zhuǎn)錄14-16。在生理濃度（10-8mol/L）RA存在時(shí)，RA與RAR上配體結(jié)合區(qū)（E區(qū)）結(jié)合，導(dǎo)致構(gòu)象改變，N-coR復(fù)合物從RAR上解離,進(jìn)而募集輔助激活因子（coactivators）復(fù)合物，包括CBP/P300、P/CAF、NcoA-1/SRC-1、P/CIP等15。其中CBP/P300和P/CAF具有強(qiáng)烈的組蛋白乙?；富钚?，乙?；M蛋白賴氨酸殘基使之帶負(fù)電而與DNA相斥，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)舒展而激活轉(zhuǎn)錄17。在APL細(xì)胞，PML-RAR或PLZF-RAR均能通過(guò)形成同二聚體或分別與RXR形成異二聚體結(jié)合在維甲酸反應(yīng)元件(

14、RARE)上，干擾RAR/RXR信號(hào)傳導(dǎo)。 臨床上，凡具有PML-RAR蛋白的APL細(xì)胞只對(duì)藥理濃度RA（10-610-7mol/L）起反應(yīng)，而具有PLZF-RAR的APL細(xì)胞反應(yīng)很差18，提示RAR、PML-RAR、PLZF-RAR三者發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能對(duì)RA濃度的依賴性不同，依次為PLZF-RARPML-RARRAR。由于三者具有相似的RA結(jié)合能力19，推測(cè)這一差別的原因跟它們與輔助抑制因子結(jié)合特性不同有關(guān)。應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，幾組作者20-23同時(shí)發(fā)現(xiàn)，生理濃度的RA（10-910-8mol/L）使RAR結(jié)合的N-coR解離，但不影響PML-RAR/N-coR復(fù)合物穩(wěn)定性。藥理濃度RA

15、（10-7210-5mol/L）可使PML-RAR/N-coR完全解離，但即使在最高濃度RA（210-5mol/L）作用下，仍有30% PLZF-RAR/N-coR復(fù)合物存在。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與PML不同，PLZF能與N-coR形成復(fù)合物，即PLZF-RAR中有兩個(gè)N-coR結(jié)合位點(diǎn)，分別位于PLZF和RAR上；而PML-RAR中，僅有一個(gè)位于RAR上。由于各自與N-coR親和力不同，構(gòu)成它們對(duì)RA反應(yīng)性不同的基礎(chǔ)：即RAR最弱，生理濃度RA使之解離；PML-RAR次之，藥理濃度才能使之解離；PLZF-RAR最強(qiáng)，藥理濃度僅能使之部分解離或者不解離。親和力增高的原因，除N-coR結(jié)合位點(diǎn)增加外，也

16、可能與PML或PLZF對(duì)RAR的構(gòu)象效應(yīng)有關(guān)。此外，另一輔助抑制因子SMART也有類似的結(jié)合動(dòng)力學(xué)特征24。結(jié)構(gòu)上，RAR上的N-coR結(jié)合位點(diǎn)位于E區(qū)N-末端，稱為CoR-Box；PLZF上的CoR-Box位于N-末端BTB/POZ區(qū)，而N-coR上21582239氨基酸序列最有利于結(jié)合PLZF。我們知道具有POZ結(jié)構(gòu)的另一轉(zhuǎn)錄因子bcl-6也通過(guò)BTB/POZ與輔助抑制因子結(jié)合，提示核激素受體、含POZ鋅指蛋白通過(guò)輔助抑制因子調(diào)控轉(zhuǎn)錄是一個(gè)普遍機(jī)制20。輔助抑制因子N-coR/SMART/mSin3復(fù)合物通過(guò)募集組蛋白去乙?；敢种妻D(zhuǎn)錄這一現(xiàn)象，進(jìn)一步被HDAC抑制劑Trichostain

17、和丁酸鈉(sodium butyrate, NaB)效應(yīng)所證實(shí)。50 nmol/L TSA能部分（50%）解除PLZF-RAR/N-coR的轉(zhuǎn)錄抑制效應(yīng)，并誘導(dǎo)PLZF-RAR轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞分化; 200 nmol/L TSA能部分恢復(fù)RA誘導(dǎo)NB4-R(RA抵抗細(xì)胞株)細(xì)胞的分化。由于是部分解除，提示除HDAC外，尚有其他因子參與轉(zhuǎn)錄抑制21。此外，PML-RAR中RAR上的CoR-Box若發(fā)生突變，喪失N-coR結(jié)合能力，也可解除PML-RAR的分化阻滯效應(yīng)22。不同轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)途徑可通過(guò)利用共同的輔助抑制因子或輔助激活因子而相互關(guān)聯(lián)。如CBP(CREB-binding protei

18、n)不僅作為RAR的輔助激活因子，也為CREB、AP-1、Stat-1等轉(zhuǎn)錄因子所必需25,26，因而RAR途徑的激活可能干擾CREB、AP-1、Stat-1等依賴的轉(zhuǎn)錄途徑，相應(yīng)地抑制cAMP、Ras、IFN-等信號(hào)路徑20。同樣，Mad/Max異二聚體對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制也需要N-coR/ mSin/ HDAC，因而PML-RAR可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性利用N-coR/ mSin/ HDAC復(fù)合物而抑制Mad/Max信號(hào)途徑27。3結(jié)語(yǔ)日益增多的證據(jù)表明，PML/PLZF-RAR對(duì)POD結(jié)構(gòu)及RAR信號(hào)傳導(dǎo)的干擾是APL發(fā)病機(jī)制的重要基礎(chǔ)。從APL細(xì)胞POD結(jié)構(gòu)在RA和砷劑應(yīng)用前后的分布及其內(nèi)容物之間相

19、互關(guān)系的改變來(lái)看，可見(jiàn)POD結(jié)構(gòu)在維持細(xì)胞增殖、分化、凋亡平衡中起著重要作用。 很多DNA病毒感染也與POD結(jié)構(gòu)改變密切相關(guān)，干擾素處理使POD數(shù)量、大小增加。目前尚不能理解這些復(fù)雜現(xiàn)象背后有無(wú)共同本質(zhì)。輔助抑制因子的介入能很好解釋融合蛋白對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特性，但PML-RAR/PLZF-RAR對(duì)N-coR親和力的不同可能不是唯一解釋RA反應(yīng)性不同的基礎(chǔ)。PML-RAR中E區(qū)點(diǎn)突變可能介導(dǎo)APL對(duì)RA發(fā)生耐藥28；RAR-PLZF依靠PLZF的7個(gè)鋅指而具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，這也可能成為對(duì)RA耐藥的重要機(jī)制29。進(jìn)一步明確在APL發(fā)病機(jī)制中哪些基因被抑制，換句話說(shuō)，哪些基因能被RA直接開(kāi)啟而使A

20、PL細(xì)胞分化，將成為下一步工作的重點(diǎn)。作者單位：200025上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院參考文獻(xiàn)1de The H, Chomienne C, Lanotte M, et al. The t(15;17) translocation of acute promyelocytic leukemia fuses the retinoic acid receptor a gene to a novel transcriptional focus. Nature, 1990, 347:558-561.2Chen Z, Brand NJ, Chen A, et al. Fusion between a

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