急性早幼粒細(xì)胞白血病發(fā)病及誘導(dǎo)分化機(jī)制研究進(jìn)展(陳竺)

1、急性早幼粒細(xì)胞白血病發(fā)病及誘導(dǎo)分化機(jī)制研究進(jìn)展中華血液學(xué)雜志CHINESE JOURNAL OF HEMATOLOGY劉廷析茅矛陳竺王振義關(guān)鍵詞：急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL） 誘導(dǎo)分化 治療急性早幼粒細(xì)胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是臨床上第一個(gè)應(yīng)用誘導(dǎo)分化治療取得成功和第一種針對(duì)腫瘤特異性標(biāo)志分子進(jìn)行治療的人類惡性腫瘤。95%以上APL患者具有特征性的非隨機(jī)染色體t（15；17）。該易位使15號(hào)染色體上的早幼粒細(xì)胞白血?。≒ML）基因與17號(hào)染色體上的維甲酸受體（RAR）基因發(fā)生融合，表達(dá)PML-RAR融合蛋白1。少數(shù)變異型APL患者產(chǎn)生t（1

2、1；17），該易位使11號(hào)染色體上的早幼粒細(xì)胞白血病鋅指（PLZF）基因與17號(hào)染色體上同樣的RAR基因發(fā)生融合，表達(dá)為PLZF-RAR融合蛋白2。在APL發(fā)病機(jī)制中，應(yīng)注意此兩種融合蛋白分別與野生型PML或PLZF、RAR蛋白共存于APL細(xì)胞中。研究表明，PML-RAR或PLZF-RAR融合蛋白可顯性失活（dominant negative）野生型PML或PLZF蛋白的功能和干擾正常RAR信號(hào)傳導(dǎo)，因而研究融合蛋白如何影響PML蛋白正常功能及RAR信號(hào)傳遞成為理解APL發(fā)病及誘導(dǎo)分化機(jī)制的關(guān)鍵。1PML蛋白的正常功能及融合蛋白對(duì)PML蛋白功能的影響早期體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，PML具有增殖抑制活性

3、3。Wang等4以敲除（knockout）PML基因小鼠作為體內(nèi)研究模型，發(fā)現(xiàn)純合缺失PML鼠(缺失兩個(gè)PML基因)有如下特征：外周血成熟粒細(xì)胞（中性、嗜酸、嗜堿、單核）顯著低于正常鼠；骨髓、肝、脾、淋巴結(jié)成熟粒細(xì)胞顯著減少；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embyonic fibroblast, MEF)增殖率和3H-TdR摻入率顯著高于正常鼠，而雜合缺失(僅缺失一個(gè)PML基因)PML鼠居中；MEF克隆形成能力增強(qiáng)，S期細(xì)胞顯著增多，G0或G1期細(xì)胞顯著減少；在誘變劑DMBA和TPA作用下，純合缺失PML鼠皮膚發(fā)生更多的乳頭狀瘤。研究表明，PML蛋白抑制增殖的機(jī)制是通過(guò)阻滯細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的。將

4、PML基因轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，Le等5發(fā)現(xiàn)cyclin D1、CDK2表達(dá)顯著下調(diào)，P53、P21WAF1/CIP1表達(dá)上升，Rb蛋白去磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞阻滯在G1期。Wang等4進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)維甲酸(RA)信號(hào)通路可能需要PML蛋白的增殖抑制活性。在甲基纖維素培養(yǎng)體系中，正常鼠的造血前體細(xì)胞形成紅系、髓系集落的數(shù)量在加入RA后明顯增加，但純合缺失PML鼠則無(wú)此效應(yīng)。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)1 mol/L RA可誘導(dǎo)正常MEF細(xì)胞表達(dá)P21WAF1/CIP1，而缺失PML的MEF細(xì)胞則無(wú)，說(shuō)明PML介導(dǎo)RA依賴的P21WAF1/CIP1表達(dá)。由于P21WAF1/CIP1能誘導(dǎo)造血細(xì)胞分化6，因而PML的功能缺失可

5、解釋APL情況下的分化阻滯。上述結(jié)果表明，PML蛋白至少部分地參與RAR/RXR信號(hào)傳遞。PML蛋白的功能發(fā)揮與它在細(xì)胞內(nèi)的定位密切相關(guān)。在正常細(xì)胞，PML蛋白以不連續(xù)點(diǎn)狀方式（speckled pattern，punctate pattern）分布在細(xì)胞核內(nèi)，電鏡下呈0.30.5 m直徑，且與核基質(zhì)相關(guān)的致密圈餅樣結(jié)構(gòu)結(jié)合稱為核體（Nuclear bodies, NB）或POD（PML Oncogenic Domain）結(jié)構(gòu)，正常細(xì)胞核約含1030個(gè)7。POD結(jié)構(gòu)實(shí)質(zhì)上為多蛋白復(fù)合體，除PML蛋白外，尚含SUMO-18、pRb9、SP10010、rfp11、NDP55、ISG-20等蛋白成分

6、。其中一些是自身免疫性疾病如原發(fā)性膽汁性肝硬化患者的核抗原7。應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)，最近發(fā)現(xiàn)POD結(jié)構(gòu)的另一個(gè)新成員是SUMO-1（Small 1 Ubiquitin-Mediated Protein）8。SUMO-1屬泛素相關(guān)蛋白Sentrin家族成員。實(shí)驗(yàn)證明SUMO-1參與PML基因的翻譯后修飾過(guò)程，并因此介導(dǎo)PML蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位8,12,主要依據(jù)有：在表達(dá)PML蛋白的Hela細(xì)胞和COS細(xì)胞，免疫沉淀試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SUMO-1與PML蛋白形成共價(jià)復(fù)合物，該結(jié)合是可逆的，且依賴磷酸化發(fā)生；采用免疫熒光雙標(biāo)記發(fā)現(xiàn)幾乎所有POD結(jié)構(gòu)內(nèi)均含有SUMO-1蛋白和PML蛋白；在非APL細(xì)胞，未經(jīng)SUMO

7、-1修飾的PML蛋白彌散分布于核基質(zhì)中，而被SUMO-1修飾的則定位于POD結(jié)構(gòu)。用As2O3處理PML細(xì)胞4小時(shí)后彌散性熒光完全消失，代之以POD結(jié)構(gòu)增多、擴(kuò)大，提示As2O3能使彌散性分布的SUMO-1和PML共定位于POD結(jié)構(gòu)中8。NB4細(xì)胞（含PML-RAR）經(jīng)RA和As2O3各處理24小時(shí)、2小時(shí)后，Western blotting顯示PML-RAR融合蛋白完全降解， POD結(jié)構(gòu)的正常定位分別于2448小時(shí)、36小時(shí)完全恢復(fù)，該時(shí)相特點(diǎn)提示：RA和As2O3通過(guò)降解PML-RAR釋放被“扣押”的PML，繼而被SUMO-1修飾再回到POD結(jié)構(gòu)中。值得注意的是，PML-RAR也能與SUM

8、O-1形成復(fù)合物，但與PML不同，SUMO-1化的PML-RAR被迅速降解，降解機(jī)制不清8。Kamitani等12認(rèn)為，PML-RAR（長(zhǎng)型、短型）均不能被SUMO-1修飾，因而不參與PML-RAR的降解。最近，利用減數(shù)文庫(kù)技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)在NB4細(xì)胞中SUMO-1可被1 mol/L RA上調(diào)，支持SUMO-1參與PML-RAR降解及POD結(jié)構(gòu)恢復(fù)這一推測(cè)。目前，尚不清楚As2O3是否調(diào)控SUMO-1表達(dá)。POD結(jié)構(gòu)中另一重要成員是低磷酸化的pRb蛋白，是第一個(gè)被認(rèn)識(shí)的腫瘤抑制基因，通過(guò)“扣押”一組E2F轉(zhuǎn)錄因子而控制細(xì)胞周期G1-S轉(zhuǎn)換。pRb亞細(xì)胞定位類似于PML，即呈彌散和顆粒狀（POD樣

9、結(jié)構(gòu)）分布，這一特點(diǎn)促使Alcalay等10研究二者的可能結(jié)構(gòu)和功能聯(lián)系。應(yīng)用免疫沉淀及免疫雙重?zé)晒獐B加(Superimposition)實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)：在體外，PML與pRb形成復(fù)合物，出現(xiàn)共沉淀；以野生型pRb和PML基因轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞，80%以上含PML的POD結(jié)構(gòu)與pRb定位在同一部位，而pRb家族其他成員（如P107、P103）則無(wú)此現(xiàn)象；在NB4細(xì)胞，盡管POD結(jié)構(gòu)解體，但PMLpRb仍共同定位于APL細(xì)胞特有的異常微顆粒樣（microspeckles）結(jié)構(gòu)中。進(jìn)一步使用不同的缺失突變體，發(fā)現(xiàn)pRb“袋區(qū)”（pocket region）中703737氨基酸為結(jié)合所必需（該區(qū)也是E

10、2F轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位），而PML中多個(gè)結(jié)構(gòu)域參與結(jié)合，其中N-末端B盒和C-末端為結(jié)合所必需，環(huán)指（ring finger）、Coiled-coil區(qū)進(jìn)一步加強(qiáng)結(jié)合。由于PML-RAR也能有效地結(jié)合pRb，但缺乏不同長(zhǎng)度的C-末端區(qū)，推測(cè)尚存在其他結(jié)合方式。功能上PML-RAR可能通過(guò)影響pRb定位，干擾其增殖抑制功能而參與APL發(fā)生。最近發(fā)現(xiàn)，Sp100的另一個(gè)選擇性剪接成分Sp100-HMG也定位于POD結(jié)構(gòu)內(nèi)，Sp100是最早發(fā)現(xiàn)的POD結(jié)構(gòu)成員，而Sp100-HMG具有非序列特異的DNA結(jié)合能力，在被共轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞，Sp100、Sp100-HMG具有轉(zhuǎn)錄抑制活性，提示POD結(jié)構(gòu)

11、參與染色質(zhì)水平上的轉(zhuǎn)錄調(diào)控9。上述結(jié)果表明，作為功能性多蛋白復(fù)合體，POD結(jié)構(gòu)通過(guò)“扣留”多種重要的胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白而影響細(xì)胞基本的病理生理過(guò)程。不僅在APL，多種DNA病毒如單純皰疹病毒型、腺病毒E4等也影響POD結(jié)構(gòu)分布，用抗病毒藥物干擾素處理后，PML的表達(dá)及POD數(shù)量、大小增加13。Muller等8認(rèn)為正常細(xì)胞內(nèi)兩種形式的PML定位（彌散型和POD結(jié)構(gòu)）存在動(dòng)態(tài)平衡，POD結(jié)構(gòu)可能是PML以及其他重要功能蛋白的貯存形式，在PML-RAR以及病毒感染等因素影響下，POD結(jié)構(gòu)解體，其內(nèi)容物釋放，引起異常的細(xì)胞病理過(guò)程。2PML-RAR對(duì)RAR/RXR信號(hào)傳導(dǎo)的影響核激素受體RAR是配體依賴性的

12、轉(zhuǎn)錄激活因子。正常情況下，RAR功能的最佳發(fā)揮有賴于與另一類維甲酸受體RXR 形成異二聚體。在RA（配體）缺乏時(shí)，RAR/RXR異二聚體的轉(zhuǎn)錄靜默效應(yīng)通過(guò)與一組輔助抑制因子（corepressors）,如SMRT(silencing mediator for retinoid and thyroid-hormone receptors)、N-coR(nuclear receptor corepressor)、mSin3形成復(fù)合物，再募集(recruit)組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)，后者使核小體組蛋白 (H2,H3,H4) 氨基-末端賴氨酸殘基去乙酰化

13、而帶正電，并與帶負(fù)電的DNA 結(jié)合，保持染色體的致密卷曲結(jié)構(gòu)從而抑制轉(zhuǎn)錄14-16。在生理濃度（10-8mol/L）RA存在時(shí)，RA與RAR上配體結(jié)合區(qū)（E區(qū)）結(jié)合，導(dǎo)致構(gòu)象改變，N-coR復(fù)合物從RAR上解離,進(jìn)而募集輔助激活因子（coactivators）復(fù)合物，包括CBP/P300、P/CAF、NcoA-1/SRC-1、P/CIP等15。其中CBP/P300和P/CAF具有強(qiáng)烈的組蛋白乙?；富钚裕阴；M蛋白賴氨酸殘基使之帶負(fù)電而與DNA相斥，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)舒展而激活轉(zhuǎn)錄17。在APL細(xì)胞，PML-RAR或PLZF-RAR均能通過(guò)形成同二聚體或分別與RXR形成異二聚體結(jié)合在維甲酸反應(yīng)元件(

14、RARE)上，干擾RAR/RXR信號(hào)傳導(dǎo)。 臨床上，凡具有PML-RAR蛋白的APL細(xì)胞只對(duì)藥理濃度RA（10-610-7mol/L）起反應(yīng)，而具有PLZF-RAR的APL細(xì)胞反應(yīng)很差18，提示RAR、PML-RAR、PLZF-RAR三者發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能對(duì)RA濃度的依賴性不同，依次為PLZF-RARPML-RARRAR。由于三者具有相似的RA結(jié)合能力19，推測(cè)這一差別的原因跟它們與輔助抑制因子結(jié)合特性不同有關(guān)。應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，幾組作者20-23同時(shí)發(fā)現(xiàn)，生理濃度的RA（10-910-8mol/L）使RAR結(jié)合的N-coR解離，但不影響PML-RAR/N-coR復(fù)合物穩(wěn)定性。藥理濃度RA

15、（10-7210-5mol/L）可使PML-RAR/N-coR完全解離，但即使在最高濃度RA（210-5mol/L）作用下，仍有30% PLZF-RAR/N-coR復(fù)合物存在。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與PML不同，PLZF能與N-coR形成復(fù)合物，即PLZF-RAR中有兩個(gè)N-coR結(jié)合位點(diǎn)，分別位于PLZF和RAR上；而PML-RAR中，僅有一個(gè)位于RAR上。由于各自與N-coR親和力不同，構(gòu)成它們對(duì)RA反應(yīng)性不同的基礎(chǔ)：即RAR最弱，生理濃度RA使之解離；PML-RAR次之，藥理濃度才能使之解離；PLZF-RAR最強(qiáng)，藥理濃度僅能使之部分解離或者不解離。親和力增高的原因，除N-coR結(jié)合位點(diǎn)增加外，也

16、可能與PML或PLZF對(duì)RAR的構(gòu)象效應(yīng)有關(guān)。此外，另一輔助抑制因子SMART也有類似的結(jié)合動(dòng)力學(xué)特征24。結(jié)構(gòu)上，RAR上的N-coR結(jié)合位點(diǎn)位于E區(qū)N-末端，稱為CoR-Box；PLZF上的CoR-Box位于N-末端BTB/POZ區(qū)，而N-coR上21582239氨基酸序列最有利于結(jié)合PLZF。我們知道具有POZ結(jié)構(gòu)的另一轉(zhuǎn)錄因子bcl-6也通過(guò)BTB/POZ與輔助抑制因子結(jié)合，提示核激素受體、含POZ鋅指蛋白通過(guò)輔助抑制因子調(diào)控轉(zhuǎn)錄是一個(gè)普遍機(jī)制20。輔助抑制因子N-coR/SMART/mSin3復(fù)合物通過(guò)募集組蛋白去乙酰化酶抑制轉(zhuǎn)錄這一現(xiàn)象，進(jìn)一步被HDAC抑制劑Trichostain

17、和丁酸鈉(sodium butyrate, NaB)效應(yīng)所證實(shí)。50 nmol/L TSA能部分（50%）解除PLZF-RAR/N-coR的轉(zhuǎn)錄抑制效應(yīng)，并誘導(dǎo)PLZF-RAR轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞分化; 200 nmol/L TSA能部分恢復(fù)RA誘導(dǎo)NB4-R(RA抵抗細(xì)胞株)細(xì)胞的分化。由于是部分解除，提示除HDAC外，尚有其他因子參與轉(zhuǎn)錄抑制21。此外，PML-RAR中RAR上的CoR-Box若發(fā)生突變，喪失N-coR結(jié)合能力，也可解除PML-RAR的分化阻滯效應(yīng)22。不同轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)途徑可通過(guò)利用共同的輔助抑制因子或輔助激活因子而相互關(guān)聯(lián)。如CBP(CREB-binding protei

18、n)不僅作為RAR的輔助激活因子，也為CREB、AP-1、Stat-1等轉(zhuǎn)錄因子所必需25,26，因而RAR途徑的激活可能干擾CREB、AP-1、Stat-1等依賴的轉(zhuǎn)錄途徑，相應(yīng)地抑制cAMP、Ras、IFN-等信號(hào)路徑20。同樣，Mad/Max異二聚體對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制也需要N-coR/ mSin/ HDAC，因而PML-RAR可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性利用N-coR/ mSin/ HDAC復(fù)合物而抑制Mad/Max信號(hào)途徑27。3結(jié)語(yǔ)日益增多的證據(jù)表明，PML/PLZF-RAR對(duì)POD結(jié)構(gòu)及RAR信號(hào)傳導(dǎo)的干擾是APL發(fā)病機(jī)制的重要基礎(chǔ)。從APL細(xì)胞POD結(jié)構(gòu)在RA和砷劑應(yīng)用前后的分布及其內(nèi)容物之間相

19、互關(guān)系的改變來(lái)看，可見POD結(jié)構(gòu)在維持細(xì)胞增殖、分化、凋亡平衡中起著重要作用。 很多DNA病毒感染也與POD結(jié)構(gòu)改變密切相關(guān)，干擾素處理使POD數(shù)量、大小增加。目前尚不能理解這些復(fù)雜現(xiàn)象背后有無(wú)共同本質(zhì)。輔助抑制因子的介入能很好解釋融合蛋白對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特性，但PML-RAR/PLZF-RAR對(duì)N-coR親和力的不同可能不是唯一解釋RA反應(yīng)性不同的基礎(chǔ)。PML-RAR中E區(qū)點(diǎn)突變可能介導(dǎo)APL對(duì)RA發(fā)生耐藥28；RAR-PLZF依靠PLZF的7個(gè)鋅指而具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，這也可能成為對(duì)RA耐藥的重要機(jī)制29。進(jìn)一步明確在APL發(fā)病機(jī)制中哪些基因被抑制，換句話說(shuō)，哪些基因能被RA直接開啟而使A

20、PL細(xì)胞分化，將成為下一步工作的重點(diǎn)。作者單位：200025上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院參考文獻(xiàn)1de The H, Chomienne C, Lanotte M, et al. The t(15;17) translocation of acute promyelocytic leukemia fuses the retinoic acid receptor a gene to a novel transcriptional focus. Nature, 1990, 347:558-561.2Chen Z, Brand NJ, Chen A, et al. Fusion between a

21、novel kruppel-like zinc finger gene and the retinoic acid receptor- locus due to a varint t(11;17) translocation associated with acute promyelocytic leukemia. EMBO J, 1993, 12:1161-1167.3He D, Mu ZM, Le XF, et al. Adenovirus-mediated expression of PML suppresses growth and tumorigenicity of prostate

22、. Cancer Res, 1997, 57:1868-1872.4Wang ZG, Delva L, Gaboli M, et al. Role of PML in cell growth and the retinoic acid pathway. Science, 1998, 279:1547-1551.5Le XF, Vallian S, Mu ZM, et al. Recombinant PML adenovirus suppresses growth and tumorigenicity of human breast cancer cells by inducing G1 cel

23、l cycle arrest and apoptosis. Oncogene, 1998, 16:1839-1849.6Liu M, Lavarone A, Freedman LP. Transcriptional activation of the human p21WAF1/CIP1 gene by retinoic acid receptor. J Biol Chem, 1996, 271:31723-31728.7Dyck JA, Maul GG, Miller WH, et al. A novel macromolecular structure is a target of the

24、 RAR oncoprotein. Cell, 1994, 76:333-343.8Muller S, Matunis MJ, Dejean A. Conjugation with the ubiquitin-related modifier SUMO-1 regulates the partitioning of PML within the nucleus. EMBO J, 1998, 17:61-70.9Seller JS, Marchio A, Sitterlin D, et al. Interaction of SP100 with HP1 proteins:a link betwe

25、en the promyelocytic leukemia-associated nuclear bodies and the chromatin compartment. Biochemistry, 1998, 95:7316-7321.10Alcalay M, Tomassoni L, Colombo E, et al. The promyelocytic leukemia gene product(PML) forms stable complexs with the retinoblastoma protein. Mol Cell Biol, 1998, 18:1084-1093.11

26、Cao T, Duprez E, Katherine L, et al. Ret finger protein is a normal component of PML nuclear bodies and interacts directly with PML. J Cell Sci, 1998, 111:1319-1329.12Kamitani T, Nguyen HP, Kito K, et al. Covalent modification of PML by the sentrin family of ubiquitin-like proteins. J Biol Chem, 199

27、8, 273:3117-3120.13Doucas V, Ishov AM, Romo A, et al. Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure. Genes Dev, 1996, 10:196-207.14Heinzel T, Lavinsky RM, Mullen T, et al. A complex containing N-CoR, mSin3 and histone deacetylase mediates transcriptional

28、repression. Nature, 1997, 387:43-48.15Grunstein M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature, 1997, 389:349-352.16James RD. Covalent modification of histones: expression from chromatin templates. Curr Opin Genet Dev, 1998, 8:173-178.17Ogryzko VV, Schiltz RL, Russanova V, e

29、t al. The transcriptional coactivators p300 and CBP are histone acetyltransferase. Nature, 1996, 384:641-643.18Guidez F, Huang W, Tong JH, et al. Poor response to all-trans retinoic acid therapy in a t(11;17) PLZF/RAR patient. Leukemia, 1994, 8:312-317 .19Dong S, Zhu J, Reid A, et al. Amino-terminal

30、 protein-protein interaction motif (POZ-domain) is responsible for activities of the promyelocytic leukemia zinc finger-retinoic acid receptor- fusion protein. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996, 93:3624-3629.20Guidez F, Ivins S, Zhu J, et al. Reduced retinoic acid-sensitivities of nuclear receptor core

31、presssor binding to PML- and PLZF-RAR underlie molecular pathogenesis and treatment of acute promyelocytic leukemia. Blood, 1998, 91:2634-2642.21Lin RJ, Nagy L, Inoue S, et al. Role of the histone deacetylase complex in acute promyelocytic leukemia. Nature, 1998, 391:811-814.22Grignani F, Matteis SD

32、, Nervi C, et al. Function proteins of the retinoic acid receptor-recruit histone deacetylase in promyelocytic leukemia. Nature, 1998, 391:815-818.23Collins SJ. Acute promyelocytic leukemia:relieving repression induces remission. Blood, 1998, 91:2631-2633.24Hong SH, David G, Wong CW, et al. SMART corepressor interacts