小建中湯抗炎免疫作用的實(shí)驗(yàn)研究

1、小建中湯抗炎免疫作用的實(shí)驗(yàn)研究         【摘要】  目的研究小建中湯的抗炎免疫作用。方法以二甲苯所致小鼠耳廓腫脹及醋酸誘發(fā)小鼠血管通透性增高的炎癥模型研究小建中湯的抗炎作用；采用小鼠炭粒廓清實(shí)驗(yàn)和溶血空斑生成，觀察小建中湯對(duì)免疫系統(tǒng)的作用。結(jié)果小建中湯對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹、醋酸誘發(fā)小鼠血管通透性增加有明顯的抑制作用，給藥組與模型組比較差異顯著；能提高吞噬指數(shù)和溶血空斑OD值。結(jié)論小建中湯具有抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用，為其臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  小建中湯 抗炎作用

2、 免疫功能Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of Xiaojianzhong decoction on anti-inflammatory and immune function of experimental animal. MethodsThe anti-inflammatory effect of Xiaojianzhong Decoction was evaluated by ear edema model induced by xylene and HAc-induced peritoneal capillary permeab

3、ility, respectively. The effects of Xiaojianzhong Decoction on specific and non-specific immune response were evaluated by haemolytic plaque forming cell and carbon clearance rate in mice. ResultsXiaojianzhong decoction could inhibit ear edema in mice induced by xylene and HAc-induced capillary perm

4、eability, and significantly increased carbon clearance rate and haemolytic plaque forming cell in normal mice.Compared with model group, there was a significant difference.ConclusionXiaojianzhong Decoction can inhibit acute inflammation and increase specific and non-specific immune function.Key word

5、s：Xiaojianzhong Decoction;   Anti-inflammatory effect;  Immune function   小建中湯首見于傷寒論，由白芍、大棗、桂枝、甘草(蜜炙)、生姜5味中藥組成，具有溫中補(bǔ)虛、和里緩急之功效1。用于治療中焦虛寒，氣血不足之證兼?zhèn)碜C，以及治脾虛腹痛兼少陽(yáng)邪郁者。因其功能建立中焦脾胃之氣，故名“建中”。本方既有雙補(bǔ)陰陽(yáng)、調(diào)補(bǔ)脾胃的作用，又有調(diào)和營(yíng)衛(wèi)兼以解表功能。由于小建中湯配伍的多層性，故應(yīng)用極為廣泛。其功能溫中補(bǔ)虛，緩急止痛主要治療脾胃虛寒所致的脘腹攣痛，喜溫喜按，或虛勞發(fā)熱等癥。歷

6、代醫(yī)家對(duì)小建中湯的論述頗多，無(wú)論是通過方論還是應(yīng)用于臨證，都顯示出小建中湯的應(yīng)用價(jià)值相當(dāng)可觀，尤其在調(diào)理或治療消化系統(tǒng)疾病(脾胃虛弱) 和增強(qiáng)體質(zhì)方面,都起著積極作用2，但是其基礎(chǔ)藥理研究?jī)?nèi)容較為少見。本文根據(jù)其臨床應(yīng)用特點(diǎn)以小鼠急性炎癥反應(yīng)、炭粒廓清實(shí)驗(yàn)以及溶血空斑生成來考察小建中湯的抗炎免疫作用。1  材料與儀器1  藥材白芍、大棗、桂枝、甘草(蜜炙)藥材飲片均購(gòu)自同濟(jì)堂藥店，生姜、飴糖購(gòu)自貴陽(yáng)紅邊門農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；所有藥材經(jīng)貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)與藥用植物學(xué)教研室陳祖云副教授鑒定，白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall的根；大棗為鼠李科植物棗Zizip

7、hus jujuba Mill.的干燥成熟果實(shí)；桂枝為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl. 的干燥嫩枝；甘草(蜜炙) 為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖；生姜為姜科植物姜Zingiber officinale Rosc. 的新鮮根莖，均符合中國(guó)藥典（2005版）要求。按照傳統(tǒng)中藥湯劑的煎煮方法煎煮，最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50濃縮至 1.2 g（以白芍生藥計(jì)）/ml。2  儀器721型分光光度計(jì)，上海分析儀器廠；上皿電子天平，上海天平儀器廠出品，型號(hào)JA-1203。3  動(dòng)物昆明種小鼠，體重1822g，兼用，

8、由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（黔）20020001。飼養(yǎng)條件：雌雄分籠飼養(yǎng)于潔凈動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，每籠10只。動(dòng)物室光照充足，通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備良好，室溫1825，相對(duì)濕度50%70%，實(shí)驗(yàn)室按常規(guī)定期消毒。2  方法2.1  二甲苯致小鼠耳廓腫脹的抑制實(shí)驗(yàn)3取小鼠40只，體重3035 g，按體重隨機(jī)分層分為4組，每組10只。小建中湯大、小劑量組給藥劑量分別為6，12 g（以白芍生藥計(jì)）/kg；模型組給予等容積的蒸餾水，給藥容積為10 ml/kg；陽(yáng)性對(duì)照組（醋酸潑尼松組）給予醋酸潑尼松20 mg/kg。各組灌胃給藥1次/d，連續(xù)7 d，末次給藥30 min后，

9、各鼠右耳分別涂以二甲苯30 l/只致炎，左耳不涂致炎液作為對(duì)照，致炎后1 h將小鼠脫頸椎處死，分別取左、右耳，用8 mm打孔器沿左、右耳廓相同部位打孔取相同大小兩耳片，電子天平稱重，以兩耳片重量差（右耳重-左耳重）作為腫脹程度的指標(biāo)；計(jì)算腫脹抑制率。   腫脹抑制率（%）=模型組腫脹度-給藥組腫脹度模型組腫脹度×100%2.2   對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響4分組與給藥同“2.1”項(xiàng)。末次給藥后45 min尾靜脈注射1%伊文思藍(lán)生理鹽水10 ml/kg，隨即腹腔注射7%冰醋酸生理鹽水溶液0.2 ml/只，15 min后脫頸椎處死，剪開腹部皮

10、膚肌肉，用6 ml生理鹽水分3次洗滌腹腔，吸管吸出洗滌液，合并后加入生理鹽水調(diào)整容積至10 ml，3 000 r/min離心15 min，取上清液在590 nm比色測(cè)定吸收度。按公式計(jì)算小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性抑制率。腹腔毛細(xì)血管通透性抑制率（%）=（模型組腹腔液A590-給藥組腹腔液A590）/模型組腹腔液A590×100%。2.3  小鼠碳粒廓清實(shí)驗(yàn)5昆明種小鼠40只，隨機(jī)分成4組，即空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照及小建中湯大、小劑量組。分組給藥同“2.1”項(xiàng)。末次給藥1 h后，各鼠尾靜脈注射中華墨水10 ml/kg，分別在1，5 min時(shí)在小鼠眼靜脈叢處用尖嘴吸管(預(yù)先用肝素濕潤(rùn))

11、吸取血液20 l，溶于2 ml 0.1%Na2CO3溶液中，在721分光光度計(jì)上于650 nm處測(cè)定吸光度(A值)。血后立刻放血處死動(dòng)物，摘取肝、脾臟，稱其濕重，按公式計(jì)算廓清指數(shù)K值K=(logA1 - logA2)/(t2 - t1)和吞噬指數(shù)值，= 體重/ (肝重+脾重)×K1/3。2.4  溶血空斑實(shí)驗(yàn)6昆明種小鼠40只，隨機(jī)分成4組。分組給藥同“2.3”項(xiàng)。末次給藥第24 h，每鼠腹腔注射4×108/ml SRBC 1 ml，將SRBC免疫4 d的小鼠脫頸椎處死，取脾臟，加入RPMI 1640液，制成均勻懸液，過200目鋼絲網(wǎng)，RPMI 1640液清洗2

12、次，制成脾細(xì)胞懸液(約5×106/ml)。取該懸液0.5 ml，加入0.2SRBC和110豚鼠血清各0.5 ml，混勻。另設(shè)不加補(bǔ)體作為空白對(duì)照，37溫育1 h后離心，3 500 r/min，離心10 min，取上清于721型分光光度計(jì)413 nm處比色，檢測(cè)溶血空斑形成情況。2.5   數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.0進(jìn)行處理分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)。3  結(jié)果3.1  二甲苯致小鼠耳廓腫脹的抑制實(shí)驗(yàn)小建中湯各組、醋酸潑尼松組與模型組比較兩耳重量差均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01或P0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示小建中湯對(duì)二

13、甲苯引起小鼠急性耳廓腫脹有明顯的抑制作用。結(jié)果見表1。表1  小建中湯對(duì)小鼠耳廓腫脹炎癥的影響（略）與模型組比較，*P0.05，*P0.013.2  小建中湯對(duì)醋酸所致小鼠血管通透性的抑制作用小建中湯高劑量組、醋酸潑尼松組對(duì)小鼠腹腔液中伊文思蘭濃度較模型組明顯減少（P0.05或P0.01），小建中湯低劑量組具有抑制小鼠毛細(xì)血管通透性的趨勢(shì)。提示小建中湯對(duì)醋酸所致毛細(xì)血管通透性的增加有顯著抑制作用，但是作用弱于醋酸潑尼松見表2。表2  小建中湯對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響（略）與模型組比較，*P0.05，*P0.013.3  小建中湯對(duì)小鼠碳粒廓清功能的

14、影響小建中湯大劑量組與空白對(duì)照組比較可明顯增加小鼠吞噬細(xì)胞的廓清指數(shù)K值和吞噬指數(shù)值（P0.05）。醋酸潑尼松組與空白對(duì)照組比較可明顯降低小鼠吞噬細(xì)胞的廓清指數(shù)K值和吞噬指數(shù)值。結(jié)果表明小建中湯可提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能。結(jié)果見表3。         表3  小建中湯對(duì)小鼠碳粒廓清功能的影響（略）與空白對(duì)照組比較,*P0.05，*P0.01；n=103.4  小建中湯對(duì)溶血空斑生成的影響小建中湯大劑量組與空白對(duì)照組比較可明顯增加小鼠溶血空斑生成，A413值顯著增加，與空白對(duì)照組比較差異顯著（P

15、0.05）。醋酸潑尼松組與空白對(duì)照組比較可明顯抑制小鼠溶血空斑生成，A413值顯著降低，與空白對(duì)照組比較差異顯著（P0.01）。結(jié)果表明小建中湯對(duì)小鼠B細(xì)胞免疫具有促進(jìn)作用。結(jié)果見表4。表4  小建中湯對(duì)小鼠溶血空斑生成的影響（略）與空白對(duì)照組比較，*P0.05，*P0.01；n=104  討論   小建中湯為仲景名方，主要適用于脾胃陽(yáng)虛，中氣不足，元陽(yáng)不振，以及陰陽(yáng)水火升降失調(diào)所致的脾胃虛寒證，中醫(yī)學(xué)中的脾胃，在生理功能和病理表現(xiàn)上大致相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的消化系統(tǒng)，并與水鹽代謝和造血系統(tǒng)密切相關(guān)。當(dāng)前臨床主要用于治療胃及十二指腸潰瘍、潰瘍性結(jié)腸炎、胃酸過多

16、、胃酸過少、慢性胃炎以及產(chǎn)后體虛等疾患7。方中白芍8、桂枝9、甘草等10有效活性成分均具有顯著的抗炎作用，本研究采用兩個(gè)炎癥模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示小建中湯對(duì)小鼠二甲苯誘導(dǎo)耳腫脹與醋酸所致腹腔毛細(xì)血管通透性增加具有顯著的抑制作用，提示小建中湯對(duì)炎癥具有顯著的抑制作用，這為其臨床應(yīng)用于消化道潰瘍等疾病提供了藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。   近年來的研究結(jié)果提示，消化道系統(tǒng)疾患與免疫系統(tǒng)功能的異常密切相關(guān)11。網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)/單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)是機(jī)體最重要的防御系統(tǒng)，其功能反映機(jī)體非特異性免疫能力，它具有強(qiáng)大而迅速的吞噬廓清異體顆?；蚰承┛扇苄援愇锏哪芰?，并能迅速清除體內(nèi)自身產(chǎn)生的某些有害物質(zhì)12。

17、本研究采用碳粒廓清實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能，小建中湯明顯提高K值和值，提示小建中湯可以提高機(jī)體非特異性免疫的能力。體液免疫是特異性免疫的重要組成部分，與細(xì)胞免疫相輔相成，共同發(fā)揮免疫作用。溶血空斑實(shí)驗(yàn)不僅反映抗體形成的細(xì)胞數(shù)量，也提示合成抗體的能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，小建中湯明顯提高溶血空斑A413的值，提示其具有增強(qiáng)機(jī)體特異性免疫系統(tǒng)能力。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，小建中湯能夠增強(qiáng)機(jī)體特異性與非特異性免疫系統(tǒng)，為臨床應(yīng)用提供了新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與理論補(bǔ)充。   本研究初步證實(shí)小建中湯的抗炎和免疫調(diào)節(jié)，其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的深入研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 許濟(jì)群. 方劑學(xué)

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