外周血多形核白細胞凋亡情況及生存率與急性胰腺炎嚴重程度相關(guān)性研究

1、外周血多形核白細胞凋亡情況及生存率與急性胰腺炎嚴重程度相關(guān)性研究 【摘要】 目的 研究急性胰腺炎大鼠模型外周血多形核白細胞即中性粒細胞（PMN）的凋亡情況及生存率與急性胰腺炎嚴重程度的關(guān)系。方法 采用在大鼠胰膽管共同通道內(nèi)逆行注射不同濃度的脫氧膽酸鈉，制備不同嚴重程度的急性胰腺炎模型。18只SD大鼠隨機分為對照組、模型1組（0.75%脫氧膽酸鈉劑量組）、模型2組（1.5%脫氧膽酸鈉劑量組）。分別于造模后6 h 處死各組存活大鼠。觀察各組大鼠的胰腺組織病理學變化、組織病理學評分，血清、腹水淀粉酶水平，腹水量及外周血清IL6、IL8水平。同時用TUNEL法分析外周血多形核白細胞凋亡情況，用流式細胞

2、分析法分析外周血多形核白細胞存活率。并與急性胰腺炎嚴重程度各項指標進行統(tǒng)計學相關(guān)分析。結(jié)果 模型1組大鼠較模型2組大鼠胰腺組織壞死及出血程度輕，組織病理學評分低，腹水及血清淀粉酶水平低，腹水量相對少,外周血清IL6，IL8水平低；病變程度較輕的模型1組大鼠外周血多形核白細胞凋亡指數(shù)比病變重的模型2組大鼠高（306 vs 204 P0.05）；病變程度較輕的模型1組大鼠外周血多形核白細胞存活率比病變重的模型2組大鼠低（56.124.21） vs （67.155.11）， P0.05。結(jié)論 急性胰腺炎時，外周血多形核白細胞凋亡指數(shù)與急性胰腺炎嚴重程度呈負相關(guān)，外周血多形核白細胞存活率與急性胰腺炎嚴

3、重程度呈正相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 多形核白細胞；凋亡；存活率；急性胰腺炎Abstract： Objective To study the relationship between apoptosis index and and severity of acute pancreatitis (AP) in rats.Methods The different severities of acute pancreatitis models of SD rats were established by retrograde injection with different concentrations

4、of sodium deoxycholate into the common bilepancreatic duct of the rats. The rats (n=18) were divided at random into control group, AP1 group (0.75% dose group) and AP2 group (1.5% dose group). The apoptosis indexes of polymorphonuclear neutrophils (PMNs) in acute pancreatitisis were analysed by TUNE

5、L method, and the survival rates of PMNs were measured by flowcytometry analysis.Results The apoptosis index was higher in the AP1 group than in the AP2 group (306 vs 204, P0.05), whereas the survival rate was lower in the AP1 group than in the AP2 group (56.124.21)% vs (67.155.11)%, P0.05. Conclusi

6、on The apoptosis index of PMNs is inversely related to the severity of AP, whereas the survival rate of PMNs is positivily related.Key words： polymorphonuclear neutrophil; apoptosis index; survival rate; acute pancreatitis 多形核白細胞即中性粒細胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）作為炎癥反應的重要標志物之一，在炎癥反應的各個階段發(fā)揮著重要作

7、用1。據(jù)以往研究表明在急性胰腺炎病程中PMN的凋亡是一種保護現(xiàn)象，可延緩急性胰腺炎的病變發(fā)展。當PMN進入抗感染狀態(tài)時，其壽命比正常循環(huán)中的PMN半衰期明顯延長，其存活及凋亡情況對炎癥發(fā)展起著重要作用。外周血PMN的凋亡指數(shù)及生存率客觀反應出外周血PMN的存在方式及組成成分，且可能與急性胰腺炎嚴重程度存在相關(guān)性。我們采用不同藥物濃度制備不同嚴重程度的急性胰腺炎大鼠模型，觀察各組大鼠的胰腺組織病理學變化、組織病理學評分，血清、腹水淀粉酶水平，腹水量及外周血清IL6、IL8水平等指標以確定急性胰腺炎病變嚴重程度，同時應用TUNEL方法分析外周血PMN的凋亡指數(shù)及應用流式細胞分析法分析外周血PMN的

8、存活率。最終分析外周血PMN凋亡及存活率與急性胰腺炎大鼠模型嚴重程度的相關(guān)性。1 材料和方法11 主要試劑及儀器（1）淋巴細胞分離液： 上海恒信化學試劑有限公司產(chǎn)品；（2）原位細胞凋亡檢測試劑盒（POD）：德國ROCHE公司產(chǎn)品；（3）DAB：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；（4）EPICSXL 流式細胞儀：美國貝克曼庫爾特公司；（5）SD大鼠：中國醫(yī)科大學動物試驗室；（6）IL6、IL8 ELISA Kit：美國Genzyme Co；（7）Annexin VFITC Kit：深圳晶美生物工程有限公司。12 實驗動物及方法121 選用健康SD大鼠18只，雌雄各9只，體重230250 g，隨機分為

9、對照組，模型1組，模型2組。其中，對照組僅常規(guī)開腹，翻動胰腺；模型1組、模型2組分別為胰膽管內(nèi)注射濃度為0.75%、1.5%的脫氧膽酸鈉制備的急性胰腺炎模型組。給藥后6h經(jīng)靜脈放血處死各組存活大鼠。122 各組留取外周血5 ml，肝素抗凝，注入已經(jīng)預置5 ml 濃度為30 g/L葡萄糖T 500離心管中，混合均勻；將離心管于恒溫箱中37靜置45 min，使RBC沉降；取上層液，以1 000r/min、離心半徑10 cm 離心10 min，去上清；將沉淀重懸于含3小牛血清的PBS中，鋪放在等體積的淋巴細胞分離液上，以1 000 r/min 離心半徑10 cm 水平離心20 min，去上清；加入1

10、 ml 0 無菌蒸餾水，靜待30 min，溶解剩余的RBC；加入1 ml 20 g/L氯化鈉溶液，構(gòu)成等滲液，以1 000 r/min 離心半徑10 cm離心10 min，去上清；將沉淀以PRMI 1640培養(yǎng)液以1 000 r/min、離心半徑10 cm 離心10 min，共2次；以含10熱滅活新生牛血清、青霉素鈉100 U/ml、鏈霉素100 U/ml 的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度為5106/ml；應用苔盼藍拒染法測定，PMN純度95%；將分離的各組PMN分別接種于24孔培養(yǎng)板，每孔細胞數(shù)5106（2 ml）；將培養(yǎng)板放置于CO2培養(yǎng)箱中，在37 ，飽和濕度，5的CO2

11、條件下孵育24 h。123 與此同時快速切取各組胰腺組織標本，置于20中性磷酸鹽緩沖液甲醛中固定，4 m 連續(xù)切片，行常規(guī)HE染色。124 留取各組標本適量血清供測定淀粉酶及IL6、IL8水平；留取各組腹水供腹水量及腹水淀粉酶水平測定。13 觀察指標及具體觀察方法131 光鏡下胰腺組織病理學改變。常規(guī)制作病理HE切片。方法按臨床病理學切片檢查方法進行。觀察各組胰腺組織病變程度及按照Kyogoku法進行組織病理學評分。132 血清淀粉酶及腹水淀粉酶測定。采用全自動生化分析檢測儀。133 腹水量測量。浸滿腹水紗布重量與浸濕前的干紗布重量之差即為腹水量。134 外周血清IL6，IL8水平檢測。采取血

12、樣后，立即進行離心，留取血清采用ELISA法進行檢測。135 用TUNEL方法檢測外周血PMN凋亡指數(shù)。其方法原理為：在末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導下，使熒光素標記的脫氧尿苷三磷酸混合到凋亡細胞DNA片斷的3OH末端，利用標記辣根過氧化物酶的羊抗熒光素的Fab段抗體于熒光素特異結(jié)合，通過DAB顯色，凋亡細胞的細胞核染色為棕色，部分細胞漿也因核DNA碎片的溢出呈現(xiàn)陽性染色。在凋亡陽性細胞分布區(qū)，400光鏡下隨機觀察連續(xù)10個高倍鏡視野，以平均每100個細胞含凋亡細胞個數(shù)為凋亡指數(shù)（apoptosis index）。 首先收集細胞以1107/ml 滴片，干燥后用4多聚甲醛室溫固定1h；PBS沖洗3次

13、；加3H2O210 min；再次PBS沖洗3次；加0.1TritonX100冰上2 min ；再次PBS沖洗3次；滴加50 l 的TUNEL反應混合液體37 濕盒避光孵育1 h；再次PBS沖洗3次；熒光顯微鏡下觀察，滴加50 l POD，在37 濕盒中孵育30 min，期間加蓋蓋玻片；再次PBS沖洗3次；滴加DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察控制顯色時間；沖洗，蘇木素復染細胞10 min，流水返藍10 min；脫水，透明，中性樹膠封片。136 用流式細胞分析法分析外周血PMN存活率。PMN生存率為除凋亡及壞死的PMN以外，起正常生理作用的生存PMN細胞占所有PMN細胞的比例。使用流式細胞分析法（A

14、nnexinV/PI雙染法），可直觀了解各組胰腺炎外周血PMN存活數(shù)量及存活率。 培養(yǎng)PMN細胞24 h 后收集PMN細胞；用去離子水按1：4稀釋結(jié)合緩沖液；用4 的冷PBS洗細胞2次，用250 l結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞，并使其濃度為1106/ml；取100 l 的細胞懸液于5 ml 流式管中，加入5 l Annexin V/FITC和10 l 20 mg/L 的碘化丙錠溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min；在反應管中加400 l PBS，流式細胞分析儀分析。AnnexinV陽性為凋亡細胞，PI陽性為壞死細胞，AnnexinV及PI雙陰性為存活細胞。14 統(tǒng)計學方法用SPSS8.0 統(tǒng)計軟件

15、進行處理，檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)標準差（xs）表示，并采用t檢驗和方差分析等方法進行相關(guān)統(tǒng)計學分析。2 結(jié)果21 光鏡下胰腺組織病理學改變對照組胰腺組織為正常改變；造模后6 h，模型1組胰腺間質(zhì)明顯水腫，炎性浸潤，胰腺實質(zhì)可見少量出血及壞死，小靜脈擴張，紅細胞沉積，粒細胞聚集和黏附；造模后6h，模型2組胰腺實質(zhì)出現(xiàn)壞死、出血及大量脂肪壞死，大量紅細胞沉積，血管擴張，可見粒細胞聚集黏附，浸潤至組織間隙，病理學改變較模型1組明顯嚴重。 由表1可見病變輕的模型1組的胰腺實質(zhì)出血、實質(zhì)壞死、空泡形成的病理評分值和總分值均低于病變重的模型2組，且差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。表1 各組胰腺組織Kyogoku法

16、組織病理學評分（略）22 腹水和血清淀粉酶及腹水量測定結(jié)果由表2可見病變輕的模型1組腹水淀粉酶、血清淀粉酶及腹水量較病變重的模型2組低，且差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。表2 各組大鼠腹水淀粉酶、血清淀粉酶及腹水量的比較（略）23 外周血清IL6、IL8水平檢測結(jié)果由表3可見病變輕的模型1組外周血清IL6、IL8水平較病變重的模型2組低，且差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。表3 各組大鼠外周血IL6、IL8水平比較（略）24 外周血PMN凋亡情況及凋亡指數(shù)（TUNEL方法）結(jié)果凋亡指數(shù)對照組為357，模型1組為306，模型2組為204。提示隨著胰腺炎嚴重程度的加劇，PMN凋亡指數(shù)降低，比較模型1

17、組及模型2組，有統(tǒng)計學意義（P0.05）。25 外周血PMN存活率（流式細胞分析法）情況PMN存活率對照組為（44.115.63）%，模型1組為(56.124.2)%，模型2組為(67.155.11)%。由此可見隨著胰腺炎嚴重程度的加劇，PMN存活率升高，且有統(tǒng)計學意義（P0.05）。第5期外周血多形核白細胞凋亡情況及生存率與急性胰腺炎嚴重程度相關(guān)性研究 孫 綱，等26 外周血PMN凋亡指數(shù)及存活率與胰腺炎病變嚴重程度相關(guān)性 由表4、5可見大鼠外周血PMN凋亡指數(shù)與胰腺炎嚴重程度呈負相關(guān)，PMN存活率與胰腺炎嚴重程度呈正相關(guān)。表4 外周血PMN凋亡指數(shù)與胰腺炎嚴重程度相關(guān)性（略）表5 外周血P

18、MN生存率與胰腺炎嚴重程度相關(guān)性（略）3 討論 急性胰腺炎， 尤其是重癥急性胰腺炎常常并發(fā)SIRS，進而發(fā)展為MODS，使治療難度加大，死亡率升高。而根據(jù)Jimenez等研究指出， 急性胰腺炎時， 炎癥反應消退依賴于PMN凋亡，急性胰腺炎患者外周血PMN凋亡明顯受到抑制。PMN是機體防御系統(tǒng)的組成部分，有“機體衛(wèi)士”之稱，是機體首先對創(chuàng)傷、感染防御反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它可迅速反應并滲出循環(huán)系統(tǒng)，進入炎癥區(qū)域，通過釋放蛋白酶和氧化代謝產(chǎn)物，如氧自由基等殺滅入侵的病原微生物和吞噬壞死組織，是機體對創(chuàng)傷、感染防御反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是組織修復的開始階段。PMN的生理效應是通過其增殖和分泌功能進行調(diào)節(jié)的。P

19、MN的數(shù)量及功能的變化與急性胰腺炎的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。當PMN進入炎癥部位時，其壽命明顯延長，衰老的PMN在沒有細胞因子和促炎介質(zhì)條件下發(fā)生凋亡，凋亡的PMN不發(fā)生細胞膜的破裂，完整被吞噬而不釋放其毒性細胞內(nèi)容物。另外，巨噬細胞吞噬凋亡PMN不會激活巨噬細胞釋放炎癥介質(zhì)，它們產(chǎn)生趨化因子和細胞因子的能力大大減弱，可以減輕組織損傷及控制炎癥嚴重程度。而循環(huán)中生存的PMN更是對抗感染起到了重要作用。在重癥急性胰腺炎時啟動了單核巨噬細胞釋放多種細胞因子如腫瘤壞死因子、白介素等，刺激PMN內(nèi)凋亡抑制蛋白，抑制PMN內(nèi)源性凋亡過程，使PMN壽命延長，免疫功能下降，進而釋放 1 Hilver ER,Cadw

20、allader KA,Reed RJ, et al. The function and fate of neutrophils at the inflamed site prospects for therapeutics interventionJ. JR Coll Physicians Lond,2000,1(34):68-74. 尚東. 全身炎癥反應綜合征中性粒細胞凋亡信號機制異常的研究進展J.國際外科學雜志，2006，33（2）：121. SongChou H,MingHo H,ChangYouh T,et al.The expression of gene modulating programmed cell death in normal human polymorphonuclear neutrophilsJ.Biochem Biophys Res Commun,1997, 233(3): 700-706. Jimenez M,Watson WG,Parodo J,et al.Dysregulated expression of neutrophil apoptosis in the systemic inflammatory responses