體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案.

1、編號(hào)頁(yè)數(shù)1/18體外培育牛黃中膽酸、 去氧安琪酵母股份有限膽酸含量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方制訂部門(mén)技質(zhì)部公司藥業(yè)分公司案頒發(fā)部門(mén)技質(zhì)部生效日期：年月日文件目錄一、 概述2二、 目的2三、 范圍2四、 職責(zé)2五、 驗(yàn)證內(nèi)容2六、 驗(yàn)證實(shí)施8七、驗(yàn)證進(jìn)度安排12八、偏差處理及報(bào)告匯總12九、驗(yàn)證結(jié)果評(píng)定與結(jié)論12十、附件12你的簽名表明你已清楚了解本文件及附件內(nèi)容，充分理解并認(rèn)可本文件的所有條款。起草人審核人審核人QA審閱批準(zhǔn)人批準(zhǔn)人部門(mén)簽名日期中心化驗(yàn)室中心化驗(yàn)室技質(zhì)部技質(zhì)部生產(chǎn)管理負(fù)責(zé)人質(zhì)量管理負(fù)責(zé)人本文件根據(jù)需要應(yīng)分發(fā)于以下部門(mén)：生產(chǎn)部辦公室調(diào)度室制劑車(chē)間技質(zhì)部原料藥車(chē)間機(jī)修車(chē)間中心化驗(yàn)室倉(cāng)儲(chǔ)檔案室安

2、琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號(hào)司藥業(yè)分公司量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案頁(yè)數(shù)2/18一、 概述2015 版中國(guó)藥典收錄的體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含量檢測(cè)使用的是薄層色譜法，此方法因其精密度不能滿(mǎn)足要求且方法落后， 無(wú)法滿(mǎn)足檢測(cè)要求， 故變更為高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。二、 目的建立體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含量的高效液相色譜法檢測(cè)的方法驗(yàn)證三、 范圍中心化驗(yàn)室四、 職責(zé)1、驗(yàn)證委員會(huì)1.1負(fù)責(zé)驗(yàn)證管理的日常工作及公司內(nèi)驗(yàn)證工作總的調(diào)度、協(xié)調(diào)及總結(jié)工作；1.2負(fù)責(zé)驗(yàn)證任務(wù)的下達(dá)及驗(yàn)證小組的確定；1.3負(fù)責(zé)驗(yàn)證計(jì)劃和驗(yàn)證方案審核和批準(zhǔn)工作；1.4負(fù)責(zé)驗(yàn)證報(bào)告的評(píng)價(jià)工作；1.5負(fù)責(zé)驗(yàn)證周

3、期的確定工作；1.6負(fù)責(zé)發(fā)放驗(yàn)證證書(shū)；2、技術(shù)質(zhì)量管理部職責(zé)2.1負(fù)責(zé)對(duì)驗(yàn)證方案和報(bào)告的可行性的審核；3、驗(yàn)證小組職責(zé)3.1負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案起草，并對(duì)批準(zhǔn)后的驗(yàn)證方案組織實(shí)施；3.2負(fù)責(zé)驗(yàn)證全過(guò)程管理并收集、整理驗(yàn)證數(shù)椐；3.3負(fù)責(zé)總結(jié)、寫(xiě)出驗(yàn)證報(bào)告；3.4負(fù)責(zé)驗(yàn)證實(shí)施過(guò)程中的檢測(cè)，并出具檢測(cè)報(bào)告；3.5 驗(yàn)證小組人員小組職務(wù)姓名所在部門(mén)職務(wù)組長(zhǎng)中心化驗(yàn)室組員中心化驗(yàn)室組員中心化驗(yàn)室五、 驗(yàn)證內(nèi)容安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號(hào)司藥業(yè)分公司量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案頁(yè)數(shù)3/181、驗(yàn)證依據(jù)、驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)：中華人民共和國(guó)藥典2015 年版2、驗(yàn)證判斷標(biāo)準(zhǔn)：準(zhǔn)確度 :6 份樣品的平均回收率限度

4、達(dá)到： 95-102% 精密度 :6 份對(duì)照品峰面積的重復(fù)性（ RSD）達(dá)到 1.5%專(zhuān)屬性 : 將樣品分別置于高溫、高濕、酸堿水解、氧化降解、強(qiáng)光照射進(jìn)行加速破壞，再測(cè)定其含量檢測(cè)限：將檢測(cè)限數(shù)據(jù)使用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證，附圖譜及結(jié)果定量限：將定量限數(shù)據(jù)使用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證，附圖譜及結(jié)果，應(yīng)符合準(zhǔn)確度、精密度要求。線性：應(yīng)有回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性圖范圍：對(duì) 80%-120%供試品溶液濃度的供試液測(cè)得的含量應(yīng)符合準(zhǔn)確度、精密度要求。耐用性： 12 小時(shí)內(nèi)分別測(cè)得的樣品含量的 RSD應(yīng)達(dá)到 1.5% 3、人員查閱人員檔案，確認(rèn)已經(jīng)對(duì)有關(guān)操作人員進(jìn)行了相關(guān)培訓(xùn)，見(jiàn)下表1：（一）人員培訓(xùn)確

5、認(rèn)記錄人 員培訓(xùn)內(nèi)容檢查結(jié)果中華人民共和國(guó)藥典2015 年版、體外培育檢驗(yàn)人員牛黃中膽酸、去氧膽酸含量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案（二）人員檔案姓 名學(xué)歷職位入廠時(shí)間培 訓(xùn)結(jié) 論是否符合要求不符合要求是否符合要求不符合要求是否符合要求不符合要求是否符合要求不符合要求是否符合要求不符合要求檢查人：日期：確認(rèn)人：日期：4、驗(yàn)證用文件文件編號(hào)文件名稱(chēng)體外培育牛黃中膽酸、 去氧膽酸含量檢驗(yàn)方存放位置安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號(hào)司藥業(yè)分公司量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案頁(yè)數(shù)4/18法驗(yàn)證方案檢查人：日期：確認(rèn)人：日期：5、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境項(xiàng)目可接受標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果結(jié)論溫度1826符合要求不符合要求濕度4565%符合要

6、求不符合要求其他干凈、整潔符合要求不符合要求6、實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：試劑膽酸對(duì)照品去氧膽酸對(duì)照品甲醇甲酸乙腈鹽酸氫氧化鈉雙氧水批號(hào)：生產(chǎn)廠家：級(jí)別 結(jié)論符合要求不符合要求符合要求不符合要求符合要求不符合要求符合要求不符合要求符合要求不符合要求符合要求不符合要求符合要求不符合要求符合要求不符合要求檢查人：儀器日期：型號(hào)確認(rèn)人：編號(hào)日期：校驗(yàn)有效期結(jié)論電子天平符合要求不符合要求高效液相色譜儀符合要求不符合要求電熱鼓風(fēng)干燥箱符合要求不符合要求檢查人：7、實(shí)驗(yàn)樣品 :檢查人：8、驗(yàn)證內(nèi)容及結(jié)果8.1 對(duì)照品溶液的制備日期：日期：批號(hào)：確認(rèn)人：確認(rèn)人：日期：生產(chǎn)廠家日期：取對(duì)膽酸、去氧膽酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)

7、定，加甲醇制成含膽酸240ug/ml和去氧膽酸安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號(hào)司藥業(yè)分公司量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案頁(yè)數(shù)5/1880ug/ml 的混合溶液，即得。8.2 供試品溶液制備取樣品適量，研細(xì)，取約 50mg，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，精密加入甲醇 50ml，稱(chēng)重，超聲處理 30min，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻， 0.45um 濾膜濾過(guò)即得。8.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱： Wondasil C18(4.6mm*250mm，5um)；柱溫：25；以 0.2%甲酸溶液（ A）- 乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（ 07min， 5%B； 715min,5%B 80%B；1

8、520min， 80%B90%B；2023min90%B96%B）；流速：1.0ml/min ；用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器； 氮?dú)饬魉伲?.3ml/min ，漂移管溫度 110。樣品中各色譜峰分離度大于 1.5 ，理論板數(shù)按膽酸峰計(jì)算應(yīng)不低于 5000。8.4 線性關(guān)系考察2ml、 4ml、6ml、8ml、 10ml，分別置于 10ml 容量瓶中，用甲醇定容精密量取對(duì)照品溶液到刻度，得到膽酸濃度分別為48、 96、144、192、 240ug/ml ；去氧膽酸濃度分別為 16、32、48、64、80ug/ml 。精密吸取各級(jí)對(duì)照品溶液 10ul注入液相色譜儀測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，

9、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程：相關(guān)系數(shù)膽酸去氧膽酸結(jié)論：檢查人：日期：確認(rèn)人：日期：8.5 供試品測(cè)定法取供試品溶液 10ul 注入液相色譜儀，依法測(cè)定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中膽酸、去氧膽酸的含量，計(jì)算，即得。8.6 、精密度取同對(duì)照品溶液 10ul 連續(xù)進(jìn)樣 6 次，測(cè)定峰面積，計(jì)算膽酸和去氧膽酸峰面積的 RSD 膽酸：峰面積RSD123456安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號(hào)司藥業(yè)分公司量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案頁(yè)數(shù)6/18去氧膽酸：峰面積RSD123456結(jié)論：檢查人：日期：確認(rèn)人：日期：8.7耐用性取供試品 10ul ，分別于 0、2、4、6、8、10、 12h 進(jìn)樣，

10、依法測(cè)定峰面積，計(jì)算得到膽酸和去氧膽酸的平均含量、RSD供試品稱(chēng)樣量：膽酸：時(shí)間（ h）峰面積溶液濃度（ug/ml ） 稀釋倍數(shù)測(cè)定結(jié)果024681012RSD去氧膽酸：時(shí)間（ h）峰面積溶液濃度稀釋倍數(shù)測(cè)定結(jié)果（ ug/ml ）02安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號(hào)司藥業(yè)分公司量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案頁(yè)數(shù)7/184681012RSD結(jié)論：檢查人：日期：確認(rèn)人：日期：8.8 準(zhǔn)確度取已知膽酸和去氧膽酸含量的樣品溶液6 份，每份約 25mg。精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液10ml，再精密加入甲醇 40ml，稱(chēng)重，超聲處理 30min，甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，分別取

11、10ul 注入液相色譜儀，依法測(cè)定，計(jì)算膽酸和去氧膽酸的平均回收率（ n=6）膽 酸 膽酸濃度 去氧膽峰 面 （ ug/ml ） 酸峰面積 積去氧膽酸稀釋倍濃 度 數(shù)（ug/ml ）膽酸膽酸去氧去氧含量回收膽酸膽酸率含量回收率123456膽酸平均回收率：去氧膽酸平均回收率：結(jié)論：檢查人：8.9 檢測(cè)限與定量限日期：確認(rèn)人：日期：安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號(hào)司藥業(yè)分公司量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案頁(yè)數(shù)8/18限；以信噪比10:1 時(shí)的進(jìn)樣量為定量限，測(cè)處膽酸和去氧膽酸的定量限。并用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證檢測(cè)限與定量限，其中定量限要包括準(zhǔn)確度（8.7 ）和精密度（ 8.5 ）實(shí)驗(yàn)。檢

12、測(cè)限圖譜：檢測(cè)限相似濃度樣品圖譜：定量限圖譜：定量限相濃度樣品圖譜：定量限相濃度樣品準(zhǔn)確度：膽膽酸去去氧稀膽膽去去酸峰濃度氧膽酸膽酸濃度釋倍數(shù)酸含酸回氧膽氧膽面積（ ug/ml ）峰面積（ug/ml ）量收率酸 含酸 回量收率123456膽酸平均回收率：去氧膽酸平均回收率：定量限相濃度樣品精密度（取樣品溶液10ul ）：膽酸：峰面積RSD12安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號(hào)司藥業(yè)分公司量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案頁(yè)數(shù)9/183456去氧膽酸：峰面積RSD123456結(jié)論：檢查人：日期：確認(rèn)人：日期：8.10 范圍取樣品適量， 研細(xì)，分別取約 40mg、60mg，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中

13、， 精密加入甲醇 50ml，稱(chēng)重，超聲處理 30min，用甲醇補(bǔ)足減失的重量， 搖勻， 0.45um 濾膜濾過(guò)，即得 80%、120%濃度的供試品，共制得供試品 6 份。按照 8.5 進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)符合準(zhǔn)確度、精密度要求。80%濃度供試品準(zhǔn)確度：膽膽 酸去酸峰濃度氧膽酸面積（ ug/ml ）峰面積123456膽酸平均回收率：去 氧稀膽膽去去膽酸濃度釋倍數(shù)酸 含酸 回氧 膽氧 膽（ug/ml ）量收率酸 含酸 回量收率去氧膽酸平均回收率：安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號(hào)司藥業(yè)分公司量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案頁(yè)數(shù)10/1880%濃度供試品精密度（取供試品10ul ）膽酸：峰面積RSD12

14、3456去氧膽酸：峰面積RSD12345620%濃度供試品準(zhǔn)確度：膽 酸膽酸濃度去氧膽去氧膽酸稀 釋 倍膽 酸膽 酸去 氧去 氧峰 面（ ug/ml ）酸峰面濃度數(shù)含量回 收膽 酸膽 酸積積（ug/ml ）率含量回 收率123456膽酸平均回收率：去氧膽酸平均回收率：20%濃度供試品精密度（取供試品10ul ）膽酸：安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號(hào)司藥業(yè)分公司量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案頁(yè)數(shù)11/18峰面積RSD123456去氧膽酸：峰面積RSD123456結(jié)論：檢查人：日期：確認(rèn)人：日期：8.11 專(zhuān)屬性8.11.1酸降解試驗(yàn)稱(chēng)取研細(xì)樣品 50mg于 50ml 容量瓶中，加 0.1

15、mol/l的鹽酸 2ml 溶解，超聲 4 小時(shí)后用甲醇定容，再超聲處理30min，搖勻， 0.45um 濾膜濾過(guò)得供試品按照 8.5 測(cè)定。8.11.2堿降解試驗(yàn)稱(chēng)取研細(xì)樣品50m于 50ml 容量瓶中，加 0.1mol/l的氫氧化鈉 2ml 溶解，超聲 4 小時(shí)后用甲醇定容，再超聲處理30min，搖勻， 0.45um 濾膜濾過(guò)得供試品按照 8.5測(cè)定。8.11.3氧化降解試驗(yàn)稱(chēng)取研細(xì)樣品 50mg于 50ml 容量瓶中，加 5%的雙氧水 2ml 溶解，超聲 4小時(shí)后用甲醇定容，再超聲處理 30min，搖勻， 0.45um 濾膜濾過(guò)得供試品按照 8.5 測(cè)定。8.11.4高溫降價(jià)將樣品存放在

16、130烘箱中考察 8 個(gè)小時(shí)，取約 50mg，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，精密加入甲醇適量 50ml，稱(chēng)重，超聲處理 30min，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾 0.45um 濾膜濾過(guò)得供試品按照 8.5 測(cè)定。8.11.5 高濕降價(jià)將樣品適量存放在相對(duì)濕度 92.5%，25（取干燥器，放入硝酸鉀飽和溶液） ，考察 5 天，取約 50mg，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，精密加入甲醇 50ml，稱(chēng)重，超聲處理 30min，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾 0.45um 濾膜濾過(guò)得供試品按照 8.5 測(cè)定。8.11.6 光降解試驗(yàn)將樣品適量置于 4500LX照度下照射 15 天，取約 50mg，精密稱(chēng)定，置于

17、錐形瓶中，精密加入甲醇適量 50ml，稱(chēng)重，超聲處理 30min，用甲醇補(bǔ)足減失的重量， 搖勻，濾 0.45um安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號(hào)司藥業(yè)分公司量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案頁(yè)數(shù)12/18濾膜濾過(guò)得供試品按照8.5 測(cè)定。條件稱(chēng)重（ mg）峰面積溶液濃度稀釋倍數(shù)測(cè)定結(jié)果（ ug/ml ）酸降解堿降解氧化降解高溫降解高濕降解光降解結(jié)論：檢查人：日期：確認(rèn)人：日期：六、驗(yàn)證實(shí)施1、驗(yàn)證開(kāi)始前， 應(yīng)組織驗(yàn)證小組成員進(jìn)行培訓(xùn)， 培訓(xùn)內(nèi)容主要為：體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案 。人員培訓(xùn)情況見(jiàn)附件 1：人員培訓(xùn)記錄。2、驗(yàn)證過(guò)程中， 如果需要修改或完善驗(yàn)證方案，應(yīng)報(bào)

18、驗(yàn)證委員會(huì)審批， 審批記錄見(jiàn)附件2：驗(yàn)證方案修改申請(qǐng)及批準(zhǔn)書(shū)七、驗(yàn)證進(jìn)度安排1、驗(yàn)證進(jìn)度安排： 2016 年月日至 2016 年月日八、偏差處理及報(bào)告匯總所有偏差的糾正，必需得到QA的批準(zhǔn)。收集所有的偏差報(bào)告，對(duì)偏差報(bào)告進(jìn)行匯總，在批準(zhǔn)最終驗(yàn)證報(bào)告之前，所有偏差應(yīng)得到 QA的批準(zhǔn)。偏差處理情況見(jiàn)附件3：偏差處理記錄偏差報(bào)告匯總見(jiàn)附件4：偏差報(bào)告匯總表九、驗(yàn)證結(jié)果評(píng)定與結(jié)論1、驗(yàn)證小組負(fù)責(zé)收集各項(xiàng)驗(yàn)證、試驗(yàn)結(jié)果記錄，根據(jù)驗(yàn)證、試驗(yàn)結(jié)果起草驗(yàn)證報(bào)告，驗(yàn)證報(bào)告見(jiàn)：體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案 。2、驗(yàn)證委員會(huì)對(duì)驗(yàn)證報(bào)告進(jìn)行綜合評(píng)審，做出驗(yàn)證結(jié)論。如果驗(yàn)證通過(guò)，則發(fā)放驗(yàn)證證書(shū)，見(jiàn)附件 5：驗(yàn)證證書(shū)。十、附件附件 1：人員培訓(xùn)記錄安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號(hào)司藥業(yè)分公司量檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案頁(yè)數(shù)13/18附件 2：驗(yàn)證方案修改申請(qǐng)及批準(zhǔn)書(shū)附件 3：偏差處理記錄附件 4：偏差報(bào)告匯總表附件 5：驗(yàn)證證書(shū)附件 1：安琪酵母股份有限公體外培育牛黃中膽酸、去氧膽酸含編號(hào)司