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1、    ?；撬釋λ穆然颊T導(dǎo)大鼠肝纖維化的抑制作用        【摘要】目的研究牛磺酸的體內(nèi)抗肝纖維化作用。方法用四氯化碳(CCl4）復(fù)制大鼠肝纖維化模型；造模開始或造模6周后給予?；撬幔粚?shí)驗(yàn)結(jié)束后分別測定肝功能、纖維化指標(biāo)(透明質(zhì)酸和層粘連素)、肝羥脯氨酸及、型前膠原mRNA含量，并作肝病理檢查。結(jié)果牛磺酸可顯著減輕CCl4肝纖維化程度，能明顯降低肝羥脯氨酸和、型前膠原mRNA含量，降低血清透明質(zhì)酸和層粘連素水平，改善肝功能，組織學(xué)檢查亦顯示具有抗肝纖維化作用。結(jié)論牛磺酸

2、在體內(nèi)具有抗肝纖維化的作用，可望用于肝纖維化的防治。【關(guān)鍵詞】?；撬岣斡不膊∧Ｐ停瑒游?Taurine protects against carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in ratsCHEN Yuexiang, LI Shi, ZHANG Xinrong, et al.Department of gastroenterology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003【Abstract】ObjectiveTo investiga

3、te the anti-liver fibrotic effects of taurine. MethodsRat liver fibrosis model was induced by carbon tetrachloride (CCl4). The hepatic levels of hydroxyproline and procollagen type and mRNA, as well as liver function tests, serum hyaluronic acid and laminin were analysed. Histological examination wa

4、s also done.ResultsTaurine ameliorated CCl4-induced liver fibrosis significantly. The liver hydroxyproline contents and expression of type and procollagen mRNA were reduced, serum hyaluronic acid and laminin decreased and liver function improved. The histological examination also demonstrated its an

5、ti-fibrotic effect.ConclusionTaurine has anti-fibrotic effect on liver in vivo, and may have potential value for clinical use.【Key words】TaurineLiver cirrhosisDisease models,animal牛磺酸是機(jī)體含量最豐富的自由氨基酸，它具有維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡、穩(wěn)定細(xì)胞膜、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)及抗脂質(zhì)過氧化損傷等多種生物學(xué)效應(yīng)，是機(jī)體自身重要的保護(hù)性物質(zhì)。我們以往證實(shí)，?；撬釋λ穆然?CCl4)、半乳糖胺及缺血再灌注性肝損傷有顯著防治

6、作用1，并可提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，抑制貯脂細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成2。本實(shí)驗(yàn)在大鼠CCl4中毒性肝纖維化模型上，觀察?；撬岬挠绊懀赃M(jìn)一步研究其抗肝纖維化作用。材料和方法一、主要試劑?；撬?湖州市生物化學(xué)試劑廠)；CCl4(宜興市第二化學(xué)試劑廠)；羥脯氨酸(上海生化研究所)；層粘連素(LN)ELISA測定試劑盒(本院臨床免疫中心)；透明質(zhì)酸(HA)放射免疫測定試劑盒(海軍醫(yī)學(xué)研究所)；異硫氰酸胍(Watson公司)；地高辛標(biāo)記及檢測試劑盒(Boehringer-Mannheim公司)；前膠原2()、2()cDNA由美國Prockop博士惠贈；其它試劑均系國產(chǎn)分析純。二、

7、動物及其分組取體重135175g雌性SD大鼠46只(本校實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。隨機(jī)分成4組：正常組(8只)，CCl4組(16只)，牛磺酸組(12只)和?；撬峤M(10只)。采用CCl4制備肝纖維化模型，即用60%CCl4橄欖油溶液0.3ml/100g體重皮下注射，每周2次，共12周。牛磺酸組在造模開始時，給予牛磺酸每日250mg/kg體重背部皮下注射。牛磺酸組在造模6周后給予?；撬?劑量、用法同上)。CCl4組除CCl4外，給予等量生理鹽水。正常組僅給予生理鹽水。各組動物在最后一次CCl4注射后48小時處死，取血分離血清，-20°C保存；同時取少許肝組織作病理檢查，其

8、余迅速液氮凍存。三、觀察指標(biāo)及方法(一) 肝功能測定：用生化分析儀測定血清ALT活性、總蛋白、白蛋白和總膽紅素含量。(二) 血清纖維化指標(biāo)測定：用ELISA法和放射免疫分析法測定LN、HA含量。(三) 肝臟羥脯氨酸測定：左葉肝臟200mg，經(jīng)6mol/L HCl水解后，用生化法測羥脯氨酸含量。(四) 肝臟、型前膠原mRNA測定：用異硫氰酸胍法抽提肝組織總RNA，所得RNA各取20g，經(jīng)甲醛變性凝膠電泳后作Northern印跡轉(zhuǎn)膜。用地高辛標(biāo)記前膠原2()、2()cDNA探針作Northern印跡雜交。雜交條帶作計算機(jī)灰度掃描。(五) 肝臟病理學(xué)檢查：取右葉肝臟以10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包

9、埋、切片，HE和VG染色作組織學(xué)檢查。四、統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以方差分析和組間q檢驗(yàn)作統(tǒng)計分析。結(jié)果一、牛磺酸對肝功能的影響CCl4組大鼠血清ALT活性、白蛋白和總膽紅素水平與正常組比較差異均有顯著性(P0.01)。用?；撬岱乐慰娠@著降低ALT和總膽紅素水平，并可提高白蛋白水平，其中早期用藥較晚期用藥肝功能改善更明顯(表1)。表1實(shí)驗(yàn)各組大鼠肝功能變化組別鼠數(shù)ALT(U/L)白蛋白(g/L)總膽紅素>(mol/L)正常組8134.3±85.628.9±1.27.7 ±2.0CCl4組12600.9±197.2*21.1

10、77;3.0*14.8±3.8*?；撬峤M10387.7±22.523.7±1.811.1±2.6?；撬峤M9358.2±142.621.9±1.914.2±5.1與正常組比較* P0.05, *P0.01與CCl4組比較P0.05,P0.01二、?；撬釋ρ謇w維化指標(biāo)的影響CCl4組動物血清LN、HA含量較正常組明顯升高(P0.01)。?；撬峤M和組LN、HA含量均較CCl4組明顯降低(P0.05或P0.01，表2)。 表2實(shí)驗(yàn)各組大鼠血清HA、LN含量變化組別鼠數(shù)HA(g/L)LN(g/L)正常組823.7±8.82

11、6.5±19.8CCl4組1190.4±31.4*148.4±82.4*?；撬峤M955.1±24.169.5±38.7?；撬峤M749.3±39.782.7±50.3與正常組比較 *P0.01與CCl4組比較 P0.05,P0.01三、?；撬釋Ω瘟u脯氨酸含量的影響CCl4組肝羥脯氨酸為1340.3±389.3g/g濕重,較正常組(217.1±132.6g/g濕重)顯著升高(P0.01)。?；撬峤M和組分別為771.3±227.6和981.1±215.4g/g濕重，較CCl4組分別降低42.

12、5%(P0.01)和26.8%(P0.05)。四、?；撬釋Ω?、型前膠原mRNA的影響Northern雜交顯示，CCl4組大鼠肝、型前膠原mRNA分別較正常組增加5.60、4.40倍；?；撬峤M和組的型前膠原 mRNA分別增加2.92、3.33倍，型前膠原mRNA分別增加2.45、3.32倍，其增加的程度均較CCl4組輕。五、肝臟病理改變1實(shí)驗(yàn)各組大鼠肝臟大體改變 注射CCl4 12周，CCl4組83.3%(10/12)肝表面布滿細(xì)小結(jié)節(jié)(1)，鏡下見典型假小葉，纖維間隔寬(2)；?；撬峤M肝病變程度較輕，僅30%(3/10)肝表面不光滑，有細(xì)小結(jié)節(jié)，鏡下見纖維組織增生，但多數(shù)呈不完全分隔，且纖維間

13、隔細(xì)窄(3)。?；撬峤M的病變程度雖較組重，但仍較CCl4組輕。用像分析儀掃描VG染色切片并計算膠原纖維分布面積百分比，結(jié)果?；撬峤M和組的膠原纖維分布面積百分比，分別為13.09%±5.72%和15.54%±4.36%，均顯著小于CCl4組(29.17%±8.17%,P0.01或P0.05)，與鏡下所見結(jié)果一致。2CCl4組肝臟VG染色切片(×100) 3牛磺酸組VG染色切片(×100) 討論肝纖維化的治療目前臨床上仍缺少理想方法3，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)體內(nèi)廣泛存在的自身抗損傷物質(zhì)?；撬峥娠@著減輕大鼠CCl4肝纖維化程度，能明顯降低肝羥脯氨酸和、型前膠原m

14、RNA含量，降低血清HA、LN水平，改善肝功能，組織學(xué)檢查也顯示具有抗肝纖維化作用。肝纖維化是肝內(nèi)ECM過量沉積的不良結(jié)局。近年研究證實(shí)，貯脂細(xì)胞是肝損傷時ECM的主要產(chǎn)生細(xì)胞4。肝內(nèi)其它細(xì)胞如肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞等均參與ECM代謝，其中肝細(xì)胞亦可能是ECM的重要來源。我們以前工作表明，?；撬峥擅黠@抑制大鼠貯脂細(xì)胞、肝細(xì)胞及小鼠成纖維細(xì)胞的增殖及其膠原等ECM合成2。本實(shí)驗(yàn)亦觀察到?；撬崽幚淼拇笫?，其肝臟形成的纖維間隔中成纖維細(xì)胞數(shù)目明顯減少(該細(xì)胞可能由貯脂細(xì)胞激活轉(zhuǎn)化而成)。故?；撬岬捏w內(nèi)抗肝纖維化的作用可能與上述作用有關(guān)。膠原生物合成中，前膠原肽鏈內(nèi)脯氨酰的羥化為膠原分子三螺

15、旋狀結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定所必需，參與羥化的酶主要為脯氨酰-4-羥化酶，抑制該酶活性可減少膠原的合成。Wang等5在博萊霉素所致大鼠肺纖維化模型上發(fā)現(xiàn)，?；撬崮茱@著減少肺內(nèi)膠原沉積，并有效抑制脯氨酰羥化酶活性。因此，?；撬嵋种聘彼岬拿复倭u化可能是其抗肝纖維化作用的又一機(jī)制。近年來，脂質(zhì)過氧化在肝纖維化發(fā)病機(jī)理中的作用得到重視?；罨酢⒊蹶庪x子、丙二醛(MDA)、乙醛以及4-hydroxynoneal等均可刺激體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞或貯脂細(xì)胞前膠原mRNA表達(dá)和膠原產(chǎn)生。有文獻(xiàn)報道，CCl4肝纖維化時，肝臟脂質(zhì)過氧化程度與羥脯氨酰含量、脯氨酰羥化酶活性呈顯著正相關(guān)，且與型前膠原mRNA分布一致6。應(yīng)

16、用抗氧化劑如Vit E則能顯著抑制肝纖維化形成。我們也發(fā)現(xiàn)，CCl4組大鼠肝臟的MDA含量顯著增加，而?；撬峥蓽p輕MDA增加的程度，提示?；撬峥赏ㄟ^抑制脂質(zhì)過氧化對肝纖維化起保護(hù)作用。?；撬釋Cl4、半乳糖胺和缺血再灌注急性肝損傷具有顯著防治效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)觀察到，應(yīng)用?；撬峥山档透卫w維化大鼠血清ALT活性和膽紅素含量，組織學(xué)檢查見肝細(xì)胞變性壞死程度得到改善，表明它對慢性肝細(xì)胞損傷亦有保護(hù)作用。作者單位：200003上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院參考文獻(xiàn)1. 陳岳祥，黃裕新，趙國寧，等.急性肝損傷大鼠腫瘤壞死因子a含量變化及?；撬嶂委熥饔玫难芯?解放軍醫(yī)學(xué)雜志，1995，20：206-207.2.

17、陳岳祥，李石，范列英，等.?；撬嵋种拼笫筚A脂細(xì)胞、肝細(xì)胞增殖及前膠原基因表達(dá).中華肝臟病學(xué)雜志，1997，5:150-152.3. 陳岳祥，李石.肝纖維化藥物治療研究現(xiàn)狀.國外醫(yī)學(xué)消化系疾病分冊，1996，16:7-10.4. Gressner AM, Bachem MG. Molecular mechanisms of fibrogenesis-A homage to the role of activated fat-storing cells. Digestion, 1995,56:335-346.5. Wang Q, Giri SW, Hyde DM, et al. Amelioration of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in hamsters by