血瘀證患者差異基因表達(dá)譜研究

1、血瘀證患者差異基因表達(dá)譜研究         09-08-13 16:04:00     編輯：studa20                         作者：馬曉娟, 殷惠軍, 陳可冀 【摘要】  目的：應(yīng)用寡核

2、苷酸基因芯片技術(shù)，研究血瘀證患者差異基因表達(dá)譜。方法：16例血瘀證患者經(jīng)冠狀動脈造影診斷后，分為冠心病血瘀證組和非冠心病血瘀證組，每組8例；并選年齡和性別相匹配的8名健康人為健康對照組。抽取靜脈血，分離白細(xì)胞，抽提RNA，質(zhì)控芯片（Test3芯片）對樣本質(zhì)量進(jìn)行檢測，然后與Affymetrix U133 Plus 2.0芯片進(jìn)行雜交，通過掃描和軟件分析，比較冠心病血瘀證組、非冠心病血瘀證組與健康對照組的基因表達(dá)譜，篩選血瘀證相關(guān)差異基因，并進(jìn)一步進(jìn)行基因本體（Gene Ontology, GO）和通路分析，使用實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法對目標(biāo)基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：通過差異基因篩選，與血瘀證

3、相關(guān)的差異基因共有48個，其中上調(diào)基因26個，下調(diào)基因22個；通過GO分析，其中與炎癥免疫相關(guān)的基因有5個，占10.4%；通路分析結(jié)果顯示，有意義的10條通路中有5個涉及炎癥和免疫反應(yīng)。經(jīng)實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證了基因芯片準(zhǔn)確可靠。結(jié)論：血瘀證基因表達(dá)譜研究顯示了炎癥和免疫相關(guān)基因的比例和顯著性優(yōu)勢，說明炎癥和免疫反應(yīng)在一定程度上介導(dǎo)了血瘀證的發(fā)生發(fā)展。 【關(guān)鍵詞】  血瘀證; 基因表達(dá)譜; 炎癥; 免疫反應(yīng)Objective: To investigate the differential gene expression profiles in patients with

4、 blood stasis syndrome by oligonucleotide microarray technique.Methods: Sixteen patients with blood stasis syndrome were divided into patients with coronary heart disease (CAD) (n=8) and nonCAD patients (n=8) by using coronary angiography. The sex and agematched eight healthy persons were enrolled a

5、s control group. Venous bloods were collected for extracting RNA. Test3 chip was first employed to examine the quality of samples. Then the samples were hybridized with Affymetrix U133 Plus 2.0 array to compare the gene expression profiles among the three groups. Genearray scanner and gene chip oper

6、ating software were applied to screen hybridization signals and analyze gene expression respectively. Based on the comparison of the three groups of samples, the differential genes related with blood stasis syndrome were analyzed by Gene Ontology (GO) and pathway, and confirmed by realtime reverse t

7、ranscription polymerase chain reaction (RTPCR).Results: Fortyeight differential genes were found being associated with blood stasis syndrome, including 26 upregulated genes and 22 downregulated genes. Five of the fortyeight genes (10.4%) were related to inflammatory reaction and immune response thro

8、ugh the GO analysis. In the pathway analysis, five of ten significant pathways were referred to inflammation and immune response. The results of realtime RTPCR proved the accuracy of the gene chip.Conclusion: Inflammatory and immunerelated genes have a remarkable predominance in blood stasis syndrom

9、e gene expression profiles, which may explain the function of inflammation and immune response in the occurrence and development of blood stasis syndrome.Keywords: blood stasis syndrome; gene expression profiling; inflammation; immune response    關(guān)于瘀血，早在內(nèi)經(jīng)中就有“惡血”、“留血”、“血凝泣”的記載，現(xiàn)代研究認(rèn)為，

10、瘀血可分為瘀滯內(nèi)結(jié)之血、離經(jīng)之血和污穢之血，而污穢之血按其來源又可分為外源性（是指生物性致病因素和理化因素所致）、內(nèi)源性（是由于重要臟器衰竭引起自身代謝產(chǎn)物的堆積）和復(fù)合性（是指外源性與內(nèi)源性因素并存）1，可見瘀血作為一種病因和病理產(chǎn)物有其發(fā)生和存在的物質(zhì)基礎(chǔ)，而近年關(guān)于瘀血的基礎(chǔ)研究主要集中在炎癥、免疫、血流動力學(xué)、血小板功能和微循環(huán)等方面。血瘀證可見于多種疾病，是一種綜合性病理狀態(tài)，形成機(jī)制非常復(fù)雜，雖然形成過程不盡相同，但卻存在著共同的病理特點(diǎn)。近年血瘀證客觀化研究發(fā)現(xiàn)，不同疾病過程中血瘀證的相關(guān)指標(biāo)也存在一定程度上類似的變化趨勢，這種相似性說明不同疾病血瘀證必然存在著共同的物質(zhì)基礎(chǔ)。本

11、研究應(yīng)用高通量的寡核苷酸芯片技術(shù)，在全基因組水平對冠心?。╟oronary heart disease, CAD）血瘀證患者、非冠心病血瘀證患者和健康對照者的基因表達(dá)譜進(jìn)行檢測，構(gòu)建血瘀證差異基因表達(dá)譜，旨在揭示與血瘀證發(fā)生發(fā)展相關(guān)的病理機(jī)制，為證的實(shí)質(zhì)研究奠定一定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。1  資料與方法1.1  臨床資料 16例實(shí)驗(yàn)組病例均來源于北京西苑醫(yī)院門診及住院病人，分為冠心病血瘀證組（8例）和非冠心病血瘀證組（8例）。參照1979年世界衛(wèi)生組織臨床命名標(biāo)準(zhǔn)化聯(lián)合專題組報告“缺血性心臟病的命名及診斷”制定入選標(biāo)準(zhǔn)2：經(jīng)選擇性冠狀動脈造影術(shù)判斷至少有1處狹窄50%以

12、上；血瘀證診斷參照中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會活血化瘀專業(yè)委員會制定的血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)2，且由3名中醫(yī)醫(yī)師盲診，辨證一致為血瘀證者入選。經(jīng)冠狀動脈造影證實(shí)為冠心病且辨證為血瘀癥的患者入選冠心病血瘀證組，經(jīng)冠狀動脈造影未證實(shí)冠心病的血瘀證患者入選非冠心病血瘀證組。病例排除標(biāo)準(zhǔn)為年齡在35歲以下或75歲以上；急性心肌梗死患者；合并1型糖尿?。桓哐獕翰?期、高血壓急癥；心功能3級等。正常對照組（8例）為年齡和性別相匹配的健康個體，并經(jīng)病史調(diào)查、體檢、心電圖及胸透等檢查排除心血管疾病病史，均為北京西苑醫(yī)院體檢中心及本院職工體檢者。以上入選對象，均為無血緣關(guān)系的漢族人，告知實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及目的并簽署知情同意書。1.2&#

13、160; 實(shí)驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)選用美國Affymetrix公司生產(chǎn)的Human Genome U133 Plus 2.0芯片，該芯片一共有54 614個探針組，分析47 000個轉(zhuǎn)錄體和變異體，其中包括了可能的38 500個已知基因；并在正式基因芯片雜交實(shí)驗(yàn)前選用Affymetrix芯片系列中的質(zhì)控芯片Test3預(yù)雜交進(jìn)行質(zhì)控，對樣品RNA的質(zhì)量及熒光標(biāo)記量提前做一個判斷，防止樣品與全基因組芯片雜交時由于樣品質(zhì)量不好而造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠。片斷化后的探針先與質(zhì)控芯片Test3進(jìn)行雜交，確認(rèn)探針質(zhì)量可靠后再與U133 Plus 2.0芯片進(jìn)行雜交，在雜交爐（Affymetrix Hybridizatio

14、n Oven 640）中45 雜交16 h，然后于Affymetrix Fluidics Station 450工作站中洗脫、染色，再用Affymetrix GeneChip Scanner 3000 進(jìn)行探針陣列掃描。芯片掃描后，用Affymetrix Genechip Operating Software Version 1.4進(jìn)行信號值提取、歸一化處理及芯片間比較分析，根據(jù)ratio值篩選差異基因。冠心病血瘀證組和非冠心病血瘀證組分別與正常對照組比較，共同的差異基因?yàn)檠鲎C相關(guān)差異基因。分析3，找到每一個差異基因的分子功能、生物學(xué)途徑和細(xì)胞組件，結(jié)合疾病病理生理過程進(jìn)一步回歸臨床，篩選血

15、瘀證相關(guān)的差異基因。通過網(wǎng)站找到每一個差異基因所在通路，并利用超幾何分布統(tǒng)計學(xué)方法4,5分析通路結(jié)果，通過P值（P<0.05）來判斷通路顯著性，篩選有意義的目標(biāo)通路。在差異基因中選擇表達(dá)差異倍數(shù)（fold change）較大和較小的6條基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction, RTPCR）驗(yàn)證。分別取冠心病血瘀證組、非冠心病血瘀證組和健康對照組樣本抽提總RNA，經(jīng)甲醛變性膠檢測后，進(jìn)一步進(jìn)行基因組DNA消化，以特異引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，確認(rèn)不變的看家基因，然后對測試基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過看家基因歸

16、一化得到靶基因的變化趨勢，驗(yàn)證基因芯片檢測的可靠性。1.3  統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)，計量資料用單因素方差分析，P0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。2  結(jié)  果2.1  臨床結(jié)果 3組研究對象在年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index, BMI）、吸煙史、飲酒史及冠心病相關(guān)家族史方面比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），兩組患者的血瘀證積分及相關(guān)病史情況也相匹配。見表1。表1  3組臨床資料（略）2.2  實(shí)驗(yàn)結(jié)果RNA樣品電泳條帶清

17、晰，核糖體RNA（ribosomal RNA, rRNA）的亞基（subunit, S）檢測28 S18 S條帶亮度接近21，紫外分光光度計檢測rRNA 260和280 nm波長的吸光度(absorbance, A)，A260/A280=1.82.1，質(zhì)量符合表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)要求。見圖1。Test3芯片與探針雜交掃描結(jié)果顯示，芯片正中“”清晰可見，外圍連線清楚，明暗交替規(guī)律，進(jìn)一步通過信號分析發(fā)現(xiàn)管家基因均表達(dá)，說明RNA樣品質(zhì)量可靠。見圖2。U133 Plus 2.0芯片與探針雜交掃描結(jié)果顯示，芯片中上部清晰呈現(xiàn)陣列的名稱“GeneChip HGU133 Plus 2”，平均背景值與噪音值均在

18、正常范圍，管家基因actin和磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH）3端與5端信號比值符合標(biāo)準(zhǔn)，芯片質(zhì)控良好。按照單通道芯片差異基因的篩選原則，分別篩選與冠心病血瘀證和非冠心病血瘀證相關(guān)的差異基因，兩者共同的部分認(rèn)為是與血瘀證相關(guān)的差異基因。共篩選出48個血瘀證相關(guān)差異基因，其中上調(diào)基因26個，下調(diào)基因22個。通過GO分析發(fā)現(xiàn)，分子功能和生物學(xué)途徑與炎癥免疫反應(yīng)相關(guān)的差異基因最多，共有5個，占10.4%。見表2。通過KEGG Genes、GenMAPP Genes、Biocarta Genes數(shù)據(jù)庫6，查詢血瘀證相關(guān)差異基因的通路，并利用超幾何分布統(tǒng)計學(xué)方法分析通路顯著性，發(fā)現(xiàn)有意義（P<0.05）的相關(guān)通路共10個，其中有5個