褪黑素對(duì)小鼠肝纖維化形成的影響

1、    褪黑素對(duì)小鼠肝纖維化形成的影響        近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)松果腺分泌的褪黑素(Melatonin,MT)有強(qiáng)大的抗氧化能力，可拮抗四氯化碳(CCl4)等所致的氧化性肝損傷1，2，但尚無(wú)MT防治肝纖維化的報(bào)道。本文在建立CCl4小鼠肝纖維化模型的基礎(chǔ)上，觀察了MT對(duì)肝纖維化形成的影響，以企探討MT防治肝纖維化的作用及其機(jī)制。 材料和方法一、材料雄性昆明系小鼠(1820g)由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心供應(yīng)，食用標(biāo)準(zhǔn)丸狀飼料。實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)分為正常對(duì)照組，CCl4模型對(duì)照組，CCl4

2、+MT組和CCl4+秋水仙堿組，每組動(dòng)物1012只。CCl4系上海新中化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，臨用前用精制茶油配成20%CCl4油劑溶液。MT和秋水仙堿(Col)分別購(gòu)自Sigma公司和上海試劑公司，溶于消毒生理鹽水中備用。二、方法(一) 小鼠肝纖維化模型制備及藥物處理：將20%CCl4油劑溶液按5ml/kg皮下注射，每5天1次，連續(xù)3個(gè)月。從用CCl4造模始，每天按20ml/kg容量灌胃給藥1次。MT組按3個(gè)劑量組(0.01mg/kg,0.1mg/kg,1.0mg/kg)分別給藥。秋水仙堿組按0.1mg/kg劑量給藥。CCl4模型對(duì)照組給予等容積的生理鹽水。(二) 病理觀察：取肝臟左葉，HE染色下按

3、下述標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判肝纖維化程度和記分3：“-”無(wú)成纖維細(xì)胞增生，記0分；“+”僅匯管區(qū)有少量成纖維細(xì)胞增生，記1分；“+”匯管區(qū)成纖維細(xì)胞增生并向小葉內(nèi)延伸，呈較窄較短的纖維條索，記2分；“+”匯管區(qū)成纖維細(xì)胞大量增生并向小葉內(nèi)大量延伸，纖維隔形成伴有小葉結(jié)構(gòu)紊亂，記3分。統(tǒng)計(jì)各組肝纖維化平均得分和標(biāo)準(zhǔn)差(肝纖維化分?jǐn)?shù))，進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。(三) 肝臟生化指標(biāo)：肝組織羥脯氨酸(HYP)含量按許志勤法4測(cè)定，肝勻漿丙二醛(MDA)含量用TBA法檢測(cè)。結(jié)果一、小鼠肝纖維化形成過(guò)程的觀察在用20%CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化形成期間，小鼠肝纖維化程度逐漸加重。30d,60d和90d時(shí)的肝纖維化分?jǐn)?shù)分別為0.43

4、±0.18,1.08±0.28,2.44±0.52，同期的羥脯氨酸含量分別為5.06±0.14,13.52±0.63,16.21±0.38，與同期正常對(duì)照組比較差異均有非常顯著性(P<0.01)。二、MT對(duì)小鼠肝纖維化形成的影響表1顯示，MT在0.11.0mg/kg劑量范圍內(nèi)，肝纖維化分?jǐn)?shù)、肝組織HYP含量和肝勻漿MDA含量均明顯下降，與同期CCl4模型組比較差異有顯著性(P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照藥秋水仙堿的療效與上述MT作用強(qiáng)度相近，但對(duì)肝勻漿MDA含量無(wú)明顯影響(P>0.05)。表1MT對(duì)小鼠肝纖維化形成的影響(

5、±s,n=10)組別用藥劑量(mg*kg-1*d-1)肝纖維化分?jǐn)?shù)肝HYP含量(g/mg)肝MDA含量(nmol/g)CCl4NS2.44±0.5216.21±0.38254.2±48.2CCl4+MT0.012.43±0.4615.63±0.45245.6±46.20.11.96±0.38*11.48±0.36*216.4±31.8*1.01.87±0.41*11.18±0.32*207.6±29.4*CCl4+Col0.11.82±0.44*10.86

6、±0.41*238.2±37.8與CCl4組比較，* P<0.05 討論長(zhǎng)期持續(xù)應(yīng)用CCl4可造成大鼠、狗等動(dòng)物的肝纖維化模型，有關(guān)小鼠肝纖維化模型報(bào)道較少3。本研究在用CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化形成過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)隨著CCl4造模時(shí)間的延長(zhǎng)，肝纖維化程度和肝臟HYP含量逐漸增加，至3個(gè)月時(shí)已形成明顯的肝纖維化征象。由于本實(shí)驗(yàn)所用的昆明種小鼠動(dòng)物價(jià)格低，動(dòng)物易于處理，肝纖維化形成呈漸進(jìn)過(guò)程，故認(rèn)為這種小鼠肝纖維化模型適合藥物防治作用的研究。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，MT有強(qiáng)大的抗氧化作用，其清除自由基的能力明顯強(qiáng)于谷胱甘肽和維生素E，可拮抗CCl4，百草枯和細(xì)菌脂多糖等所致肝氧化性損傷1

7、。由于肝氧化性損傷與肝纖維化的形成關(guān)系密切5，因而本文研究了MT對(duì)小鼠肝纖維形成的影響。發(fā)現(xiàn)MT在降低肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量的同時(shí)，明顯抑制肝纖維化的形成，使肝臟纖維化分?jǐn)?shù)和肝臟HYP含量明顯下降。同期使用的陽(yáng)性對(duì)照藥秋水仙堿雖有類(lèi)似抗肝纖維化作用，但由于MT具有抗氧化損傷的獨(dú)特作用，且毒性小，安全性較高1，故有進(jìn)一步深入研究的前景。安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.98-醫(yī)-08)作者單位：230022合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院參考文獻(xiàn)1.Reiter RJ,Melchiorri D,Sewerynek E,et al.A review of the evidence supporting

8、 melatonin's role as an antioxidant.J Pineal Res,1995,18:1-11.2.William MUD,Reiter RJ,Melchiorri D,et al.Melatonin counteracts lipid peroxidation induced by carbon tetrachloride but did not restore glucose-6-phosphatase activity.J Pineal Res,1995,19:1-6.3.程明亮，劉三都.肝纖維化與早期肝硬化.見(jiàn)：程明亮，劉三都主編.肝纖維化的基礎(chǔ)研究和臨床研究.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：130-156.4.許志勤，高蘭英.組織羥脯氨酸測(cè)定方法.解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，1990，8：40-42.5.Britton RS and B