細胞計數(shù)與測量 郭森

1、微生物大小的測量與微生物計數(shù) 郭森 09級生命基地 200900140029 周二下午 第五排摘要：本實驗的目的是學習掌握顯微測微尺測定微生物大小和用血細胞計數(shù)板測定微生物細胞數(shù)量的方法。本次實驗是使用顯微測微尺測量枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的大小，使用血細胞計數(shù)板對釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的發(fā)酵液中的菌體進行計數(shù)。實驗中分別對兩種菌種的大小進行了測量，對釀酒酵母發(fā)酵液中的菌體進行了計數(shù)，并得到了多組測量數(shù)據(jù)。關(guān)鍵詞：微生物大小的測量；顯微測微尺；顯微鏡直接計數(shù)法；血細胞計

2、數(shù)板前言：微生物菌體的大小和微生物菌體的數(shù)量是微生物的重要特征，可以通過測量微生物菌體的大小和微生物菌體的數(shù)量來判斷微生物的生長狀況。微生物大小的測定需借助特殊的目鏡測微尺和鏡臺測微尺互相配合作為測量工具。其中在進行測量前要先使用鏡臺測微尺對目鏡測微尺進行校正?！?】微生物計數(shù)常用的直接計數(shù)法是利用特定的細菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積內(nèi)的微生物的數(shù)量，而后利用菌液稀釋倍數(shù)和體積關(guān)系求得每升菌液內(nèi)微生物的數(shù)量?！?】1 材料和方法1.1材料菌種 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。溶液與試劑 0.1%

3、呂氏堿性美藍染液，蒸餾水。儀器及其他用品 目鏡測微尺，鏡臺測微尺，普通光學顯微鏡，擦鏡紙；血細胞計數(shù)板，移液管，小玻璃珠，燒杯，錐形瓶等。1.2方法【1】顯微測微尺測量微生物大小.1目鏡測微尺的安裝 取出目鏡，將目鏡測微尺刻度朝下放在目鏡鏡筒內(nèi)的隔板上，然后將目鏡插回鏡筒內(nèi)。.2校正目鏡測微尺 將鏡臺測微尺刻度面朝上放在顯微鏡在物臺上。先用低倍鏡觀察，將鏡臺測微尺有刻度的部分移至視野中央，調(diào)節(jié)焦距，當清楚地看到鏡臺測微尺的刻度后，旋轉(zhuǎn)目鏡使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度平行。利用推進器移動鏡臺測微尺，使兩尺的某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，然后分別數(shù)出兩重和線之間鏡臺測微尺和目鏡測微尺所占的格數(shù)。

4、用同樣的方法換成高倍鏡和油鏡進行校正。分別測出在高倍鏡下和油鏡下兩重合線之間兩尺分別所占的格數(shù)。目鏡測微尺每格長度（um）=兩重合線鏡臺測微尺格數(shù)x10/兩重合線間目鏡測微尺格數(shù).3菌體大小測定 目鏡測微尺校正完畢后，取下鏡臺測微尺，換上美藍染色的枯草芽孢桿菌制片。先用低倍鏡找到菌體后，使用高倍鏡測定枯草芽孢桿菌的寬度和長度。用測得的格數(shù)乘以算得的每格長度即得枯草桿菌的具體長寬。用同樣的方法測量釀酒酵母的直徑。.4測定完畢測定完畢后，取出目鏡測微尺，將目鏡測微尺與鏡臺測微尺分別用擦鏡紙擦凈，放回盒內(nèi)保存。直接計數(shù)法測量微生物數(shù)量.1酵母菌懸液制備將釀酒酵母的發(fā)酵液搖勻，用1ml移液管移取1ml

5、，將其注入裝有玻璃珠的錐形瓶中，用10ml移液管移取19ml蒸餾水注入相同錐形瓶中，搖晃20min。.2檢查血細胞計數(shù)板在加樣前，先對血細胞計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。若有污物，可用自來水沖洗，再用95%乙醇棉球輕輕擦洗，然后用吸水紙吸干或電吹風吹干。.3加樣品將清潔干燥的血細胞計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母懸液由蓋玻片的邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數(shù)室。靜置5min，使細胞自然沉降。.4顯微鏡計數(shù) 將加有樣品的血細胞計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)。每個計數(shù)室選五個中格中的菌體進行計數(shù)。位于格線上的菌體一般

6、只數(shù)上方和右邊線上的。若酵母出芽，芽體大小達到母細胞一半時，即作為兩個菌體計數(shù)。.5清洗使用完畢后，將血細胞計數(shù)板及蓋玻片清洗干燥，放回盒中，以備下次使用。2 實驗結(jié)果與分析2.1實驗結(jié)果測定微生物大小（見表1，2，3,4）（1）目鏡測微尺校正結(jié)果（表1） 表1 目鏡測微尺校正結(jié)果物鏡 物鏡倍數(shù) 目鏡測微尺格數(shù) 鏡臺測微尺格數(shù) 目鏡測微尺代表的長度/um低倍鏡 10 58 30 5.172 高倍鏡 40 79 10 1.266油鏡 100 20 1 0.500 目鏡放大倍數(shù)：10(2)微生物大小測定結(jié)果（見表2、3、4） 表2 枯草芽孢桿菌大小測定記錄（單位:目鏡測微尺格數(shù)） 1 2 3 4

7、5 6 7 8 9 10 平均寬度 2 2 2 2 2 1.8 1.8 2 2 2 1.96 長度 17 21 18 20 19 19 20 19 21 22 17.7 目鏡放大倍數(shù)：10 物鏡放大倍數(shù)：100 表3 釀酒酵母大小測定記錄（單位:目鏡測微尺格數(shù)） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均直徑 4 5 4 3 4 4 5 5 6 3 4.3 目鏡放大倍數(shù)：10 物鏡放大倍數(shù)：40 表4 各菌測定結(jié)果微生物名稱目鏡測微尺每格代表的長度/um寬長菌體大小目鏡測微尺平均格數(shù)寬度/um目鏡測微尺平均格數(shù)長度/um枯草芽孢桿菌釀酒酵母0.500 1.2661.964.30.98005

8、.443817.78.8500.9800um×8.850 um 5.4438um注：釀酒酵母用直徑（寬度）表示細胞大小，枯草芽孢柑橘用寬度×長度表示細胞大小 顯微計數(shù)法測量釀酒酵母菌體數(shù)量（見表5） 表5 顯微計數(shù)結(jié)果各中格菌數(shù)AB兩室平均值菌數(shù)/ml12345釀酒酵母第1室109121211591756.24.78×107第2室1113109115417注：A表示5個中方格中總菌數(shù) ，B表示菌液稀釋倍數(shù) 1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B2.2結(jié)果分析由表4中各菌測定結(jié)果可知，枯草芽孢桿菌的長寬比大約為9:1，與顯微鏡下

9、觀察結(jié)果較相符，顯微鏡下枯草芽孢桿菌明顯呈細長狀，且有些枯草芽孢桿菌連在一起會阻礙觀察和測定；釀酒酵母在顯微鏡下大多呈圓形和橢圓形，因此為了測量方便便記錄圓形酵母菌的大小，其大小接近5.5um，比枯草芽孢桿菌稍小。在測量中，因為活菌的游動、以及測微尺的準確度等等給測量帶來了一些困難也造成了一定誤差。在血細胞計數(shù)板測量微生物數(shù)量的實驗中，酵母菌發(fā)酵液濃度的稀釋顯得非常重要。如果稀釋后濃度過大，則會導致計數(shù)室中菌體太過稠密，每一格中菌體數(shù)量過多造成無法測量。因此酵母菌發(fā)酵液要稀釋大約二十倍左右才能保證菌液分布的平均，并且要保證搖晃的時間夠長，才能保證計數(shù)的方便和準確。因此本實驗中我們將酵母菌發(fā)酵液稀釋到十七倍，在每一中格中約能找到913個釀酒酵母菌。3小結(jié)本次實驗中，我們學習了如何使用顯微測微尺測量細胞大小和使用血細胞平板計數(shù)法測量微生物的數(shù)量，基本上掌握了其原理與操作，對微生物形態(tài)特征的測定有了一定的了解和掌握，對細菌和真菌形態(tài)與大小的對比有了一定的認識，使我們收獲很多。在進行微生物形態(tài)和數(shù)量的測量時要看清實驗要求和具體情況，