RP-HPLC法測定馬兜鈴酸含量方法的優(yōu)化

1、RP-HPLC法測定馬兜鈴酸含量方法的優(yōu)化                 作者：杜曉曦,周躍華,路金才,韓娜,周娟,畢開順【摘要】  目的 優(yōu)化高效液相色譜法對馬兜鈴酸進行含量分析。方法 通過比較不同提取溶劑、不同提取方法,確定較為合理的供試品溶液制備方法。比較不同流動相條件對馬兜鈴酸含量測定的影響,選擇含量分析色譜條件。測定不同波長下的最低檢出限度,確定痕量分析條件。結(jié)果 供試品溶液制備中以70%甲醇直接加熱回流提取,效率

2、優(yōu)于其他提取方法。做一般含量分析時可以選擇流動相為甲醇-1%醋酸水溶液(7030)或乙腈-0.3%(NH4)2CO3(pH=7.5) (2575),250 nm或319 nm作為檢測波長。做痕量分析時宜選擇流動相為乙腈-0.3%(NH4)2CO3(pH=7.5)(2575),并選擇檢測波長為224 nm,最小檢出量可達0.02 ng。結(jié)論 本實驗所建立的方法可以準確可靠的進行馬兜鈴酸含量分析并進行痕量檢查。 【關(guān)鍵詞】  馬兜鈴酸；高效液相色譜法；含量測定    Abstract：Objective To optimize the RP-HPLC pro

3、cedure for the determination of aristolochic acid. Method Different extraction solvents and methods have been screened to get the most efficient way for sample preparation. The influence of different mobile systems on quantitation were compared to choose an approprate mobile system for determination

4、. Besides, the minimum limits of different detecting waves were measured to give the method to detect trace amount of aristolochic acid. Result Refluxing with 70% methanol was better than other ways in sample preparation. Both methanol-1% acetic acid (7030) solution and 0.3% ammonium carbonate solut

5、ion (pH=7.5)-acetonitrile (7525) with wavelength of 250 nm and 319 nm can be used for quantitation while 0.3% ammonium carbonate solution (pH=7.5)-acetonitrile (7525) with wavelength of 224 nm for trace detection. The minimum detectable amount was 0.02 ng. Conclusion The method established can be ap

6、plied to determinate aristolochic acid and detect trace amout exactly.    Key words：aristolochic acid；RP-HPLC procedure；sample preparation；chromatographic condition馬兜鈴酸是馬兜鈴科植物中的主要成分,近年來已證實其具有腎臟毒性。鑒于馬兜鈴科植物種類很多,名稱混淆現(xiàn)象也很常見,各地方用藥種類十分復(fù)雜,所以,有必要建立一個簡單有效、便于推廣的方法對馬兜鈴酸進行定量分析,以便真實準確地反映出藥材或制劑中馬兜鈴

7、酸的含量,保證用藥安全。目前,高效液相色譜法是在馬兜鈴酸含量測定中使用最多、發(fā)展也較為成熟的一種方法,但測定條件多種多樣。為此,本試驗從供試品溶液的制備、色譜條件的選擇兩個方面進行了研究,以期建立并推薦一個能準確反映馬兜鈴酸含量的高效液相色譜法。1  儀器與試劑    美國科普公司SSI PC3000高效液相色譜儀,Model 500紫外檢測器,HORIBA B-212PH計,Anastar色譜工作站。色譜純試劑購自天津康科德化學試劑廠,分析純試劑購自山東禹王化學試劑廠。關(guān)木通(兩年生)采自沈陽藥科大學藥用植物園,馬兜鈴酸A對照品購自中國生物制品檢定所(

8、批號110746-200204)。2  供試品溶液的制備 2.1  提取溶劑的選擇    現(xiàn)有的研究中,馬兜鈴酸的提取溶劑多數(shù)選擇甲醇、乙醇、丙酮或加入一定量的酸來提取,有文獻報道,丙酮-10%甲酸提取效率較高。我們也重點考察了該濃度酸及常用溶劑對提取效率的影響。取干燥關(guān)木通藥材粉末(40目),精密稱定30份,各0.5 g,分別加入表1所示溶劑各20 mL,每種溶劑各提取2份,共30份,分別浸泡2 h,超聲15 min,過濾,濾液蒸干,殘渣以甲醇溶解,定容至10 mL容量瓶中,微孔濾膜過濾后,供HPLC測定用。結(jié)果見表1。表1  不同

9、提取溶劑的比較（略）從實驗數(shù)據(jù)看,甲醇、乙醇不適宜對馬兜鈴酸進行提取,加入酸或醇水溶液,可使馬兜鈴酸的提取效率顯著增加,綜合比較各種溶劑,70%甲醇對馬兜鈴酸的提取效率最高,可以作為馬兜鈴酸的最優(yōu)提取溶劑。2.2  提取方法的選擇    索氏提取法：取0.5 g關(guān)木通藥材粉末4份,以70%甲醇120 mL分別索氏提取1、2、3.5、5 h,分別測定含量,結(jié)果表明3.5 h后峰面積不再增加。直接加熱回流法：取關(guān)木通粉末1份,提取溶劑為70%甲醇25 mL,提取1 h,過濾,濾液進行含量測定,濾渣再重復(fù)提取2次,分別得濾液并測定含量。結(jié)果表明,關(guān)木通提取1次

10、即1 h即提取完全。超聲提取法：取關(guān)木通粉末1份,提取溶劑為70%甲醇25 mL,提取15 min,過濾,濾液進行含量測定,濾渣再重復(fù)提取4次,分別得濾液并測定含量,結(jié)果表明,關(guān)木通重復(fù)提取4次即1 h,即提取完全。見圖1。    從圖1可以看出,在提取完全的情況下,超聲提取法需提取4次,耗費1 h,消耗溶劑共100 mL；索氏提取法需提取3.5 h,消耗溶劑120 mL；直接加熱回流法需提取1次,提取1 h,消耗溶劑25 mL,即可提取完全。故建議選擇直接加熱回流法提取。3  色譜條件3.1  流動相對馬兜鈴酸含量測定的影響 

11、60;  從大量的文獻報道來看,馬兜鈴酸含量測定的流動相一般使用甲醇-水系統(tǒng)1、乙腈-水系統(tǒng)2,另有采用乙腈-0.3% (NH4)2CO3(pH=7.5)3系統(tǒng),本試驗對不同流動相系統(tǒng)甲醇-水-冰醋酸(70301)、乙腈-水-冰醋酸(50501)、乙腈-0.3% (NH4)2CO3(pH=7.5,2575)進行了比較,見表2。    由表2可以看出,3種流動相條件均可與其他成分實現(xiàn)基本分離,理論塔板數(shù)也符合定量分析的要求,但在乙腈-水系統(tǒng)下,馬兜鈴酸計算含量偏低。表2  不同流動相系統(tǒng)的比較（略）3.2  低酸度對色譜分離的影響

12、60;   由于馬兜鈴酸屬于酸性物質(zhì),流動相中加入適量的酸可以改善峰形,但是酸的加入將會影響色譜住的使用壽命,本節(jié)探討不同酸度對馬兜鈴酸分離的影響,結(jié)果見表3。表3  低酸度對色譜分離的影響（略）從表3可以看出,甲醇-1%醋酸水溶液流動相條件分離度良好,理論塔板數(shù)符合定量分析要求,降低酸度不影響色譜分離,甲醇-1%醋酸水溶液適合作為含量測定的流動相條件。3.3  痕量分析時色譜條件的選擇    儀器及方法的檢測限度是進行馬兜鈴酸痕量分析的重要指標,為確保用藥的安全性,要求色譜條件具有較低的檢測限。馬兜鈴酸有4處最大吸收,即2

13、24、250、319、390 nm。取配置好的0.05 mg/mL馬兜鈴酸對照品溶液,采用無限稀釋法,流動相選擇甲醇-1%醋酸水溶液及乙腈-0.3%(NH4)2CO3(PH=7.5),并配以不同檢測波長進行最低檢出限度的考察,結(jié)果見表4。表4  不同色譜條件的最低檢測限度(略)從表4可以看出,乙腈-0.3%(NH4)2CO3(pH=7.5)配以224 nm檢測波長可以獲得最低的檢出限度(見圖2),該條件可用于限度檢出。    此外,根據(jù)樣品在不同波長下的最低檢測限可以看出,樣品在390 nm處檢測限較高,不適合作為馬兜鈴酸含量測定時的檢測波長,而250

14、nm及319 nm檢測波長下檢出限較低(<1 ng),信號相對較高,適合作為含量分析的檢測波長。同時,考慮到224 nm檢測波長在復(fù)雜樣品分析時易出現(xiàn)雜質(zhì)峰干擾,不建議作為含測檢測波長。4  小結(jié)與討論    本試驗對高效液相色譜方法測定馬兜鈴酸含量的供試品溶液的制備方法進行了條件優(yōu)化選擇,確定供試品溶液的制備方法為70%甲醇直接加熱回流法進行提取。    在流動相選擇上,研究發(fā)現(xiàn),甲醇-1%醋酸水溶液(7030) 及乙腈-0.3%(NH4)2CO3(pH=7.5)可以滿足馬兜鈴酸含量分析需要,結(jié)果較為準確。當藥材中馬

15、兜鈴酸含量較低,需進行痕量分析時宜選擇流動相為乙腈-0.3%(NH4)2CO3(pH=7.5),檢測波長為224 nm。    本試驗首次對甲醇-水分離馬兜鈴酸的酸度進行了考察,發(fā)現(xiàn)采用低酸度的甲醇-1%醋酸水溶液對馬兜鈴酸進行含量測定,不僅可以獲得良好的分離效果,且可以減緩流動相對色譜柱的損耗,適宜用作馬兜鈴酸的含量測定方法?！緟⒖嘉墨I】  1 由麗雙,王智民,姜 旭,等.HPLC法測定不同產(chǎn)地關(guān)木通中馬兜鈴酸A的含量J.中國中藥雜志,2003,28(5)：465467.2 Chang YS, Deng JS, Ku YR. Determination of aristolochic acid in traditional Chinese prescriptions, containing Radix Aristolochiae Fangchi by HPLCJ.J Liquid chromatography