PCR檢驗實驗室檢查要點指南

1、PCR檢驗實驗室檢查要點指南2016年8月31日，北京市食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了PCR檢驗實驗室檢查要點指南（2016版），具體內(nèi)容如下：聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢驗實驗室檢查要點指南（2016版）聚合酶鏈反應(yīng)檢驗實驗室是指通過基因擴增的方式檢測特定的DNA或RNA的檢驗實驗室。聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種在體外特異性擴增靶DNA序列的技術(shù)，其基本過程為模板雙鏈DNA的變性、引物與模板DNA的退火和在DNA 聚合酶引導(dǎo)下的鏈延伸反應(yīng)三個階段的多次循環(huán)。每一次循環(huán)后的擴增產(chǎn)物均可作為下一輪循環(huán)的模板，理論上，擴增產(chǎn)物量呈指數(shù)形式上升，即經(jīng)過n個循

2、環(huán)后，產(chǎn)物量增加到2n倍。PCR試劑操作簡單，短時間內(nèi)在體外可獲得數(shù)百萬個特異靶DNA序列的復(fù)制，為臨床疾病的診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后評估提供了一種極有幫助的實驗室輔助手段。PCR檢驗實驗室是PCR試劑生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品檢驗過程中不可缺少的工作環(huán)境，其環(huán)境控制水平和質(zhì)量管理水平直接影響著最終產(chǎn)品是否合格，能否放行。由于該產(chǎn)品本身的特殊性，醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑、醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范體外診斷試劑現(xiàn)場檢查指導(dǎo)原則條款中，明確對PCR試劑的生產(chǎn)和檢驗環(huán)境做出規(guī)定。此外現(xiàn)行衛(wèi)生行業(yè)的法規(guī)、標準以及相關(guān)文獻中對于PCR檢驗實驗室均作出規(guī)定，主要涉及全國臨床檢驗規(guī)程（第三版）、醫(yī)療機構(gòu)臨床基

3、因擴增管理辦法（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)2010194號）、醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導(dǎo)則及臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的應(yīng)用（WS/T 230-2002）等行業(yè)標準的相關(guān)要求。本檢查指南旨在幫助北京市醫(yī)療器械監(jiān)管人員增強對PCR檢驗相關(guān)過程的認知和把握，指導(dǎo)全市醫(yī)療器械監(jiān)管人員對PCR檢驗實驗室設(shè)計建設(shè)與質(zhì)量控制的監(jiān)督檢查工作。同時，為PCR試劑生產(chǎn)企業(yè)在PCR檢驗實驗室的設(shè)計建造和管理要求提供參考。當國家相關(guān)法規(guī)、標準、檢查要求發(fā)生變化時，應(yīng)當重新討論以確保本檢查指南持續(xù)符合要求。適用范圍本檢查指南可作為北京市食品藥品監(jiān)督管理局組織、實施的體外診斷試劑產(chǎn)品注冊質(zhì)量管理體系現(xiàn)場核查、醫(yī)療器

4、械生產(chǎn)許可證現(xiàn)場核查、醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)督檢查等各項涉及PCR檢驗實驗室檢查的參考資料?；驕y序檢驗實驗室等涉及PCR試劑的相關(guān)部分應(yīng)當參照本檢查指南執(zhí)行。核查要點（一）現(xiàn)場查看生產(chǎn)企業(yè)PCR檢驗實驗室布局生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當提供PCR檢驗實驗室設(shè)計方案和/或平面設(shè)計圖（應(yīng)當標明風(fēng)向或壓差梯度）。1.PCR檢驗實驗室與PCR試劑生產(chǎn)區(qū)域應(yīng)當在各自獨立的建筑物或空間內(nèi)，保證空氣不直接聯(lián)通，防止擴增時形成的氣溶膠造成交叉污染。2.原則上PCR檢驗實驗室應(yīng)當設(shè)置以下區(qū)域：試劑儲存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當合并。若使用實時熒光定量PCR儀且不需要進行后續(xù)產(chǎn)物分析工

5、作，擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。若使用樣本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，則標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。3.各區(qū)域在物理空間上應(yīng)當完全相互獨立，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應(yīng)當始終處于完全的分隔狀態(tài)。不應(yīng)當只是形式上的分區(qū)，不應(yīng)當是一個區(qū)域嵌套一個區(qū)域。4.各區(qū)域不應(yīng)當有空氣的直接相通。擴增區(qū)與擴增產(chǎn)物分析區(qū)各區(qū)域宜采用獨立直排方式出風(fēng)。采用空調(diào)機組方式的，PCR檢驗實驗室應(yīng)當具備獨立空調(diào)機組；同時應(yīng)當考慮停機后各房間空氣連通的可能性，采取必要的控制措施。5.按照試劑儲存和準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)方向空氣壓力應(yīng)當以遞減的方式進行，使得PCR檢驗實

6、驗室的空氣流向應(yīng)當按照試劑儲存和準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)方向進行，防止擴增產(chǎn)物順空氣氣流進入擴增前的區(qū)域?？諝饬飨驊?yīng)當為單向，禁止下游污染上游。應(yīng)當設(shè)置合理的壓差梯度，并安裝壓差監(jiān)測裝置，以有效證明空氣流向，壓差梯度不宜低于5帕。6.設(shè)置緩沖間的，緩沖間內(nèi)通向內(nèi)實驗室和走廊的門應(yīng)當安裝連鎖裝置或采取相應(yīng)措施，避免出現(xiàn)兩個門同時打開的情況。7.各區(qū)間若設(shè)置傳遞窗，應(yīng)當為雙側(cè)開門，要求密封嚴實，并且兩側(cè)的門應(yīng)當為互鎖裝置或采取相應(yīng)措施保證兩側(cè)門不會同時開啟。（二）現(xiàn)場查看儀器設(shè)施配置1.試劑儲存和準備區(qū)的功能：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應(yīng)混合液的準備，以及離心管、吸頭等消耗品的

7、貯存和準備。配套用品一般應(yīng)當包括：（1）溫度調(diào)控范圍為28和（或）-20以下冰箱；（2）混勻器；（3）微量加樣器；（4）紫外消毒設(shè)備；（5）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭；（6）專用工作服和工作鞋(套)；（7）專用辦公用品。2.標本制備區(qū)的功能：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及加樣。配套用品一般應(yīng)當包括：（1）溫度調(diào)控范圍為28和（或）-20以下冰箱；（2）高速離心機；（3）混勻器；（4）水浴箱或加熱模塊；（5）微量加樣器；（6）紫外消毒設(shè)備；（7）生物安全柜；（8）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）；（9）專用工作服和工作鞋(套)；（10）專用

8、辦公用品；（11）如需處理大分子DNA，應(yīng)當具有超聲波儀。3.擴增區(qū)的功能：cDNA合成、DNA擴增及檢測。配套用品一般應(yīng)當包括：（1）核酸擴增儀；（2）微量加樣器；（3）紫外消毒設(shè)備；（4）消耗品：一次性手套、一次性帽子、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）；（5）專用工作服和工作鞋；（6）專用辦公用品。4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)的功能：擴增片段的進一步分析測定。視檢驗方法不同而定，基本配置如下：（1）微量加樣器；（2）紫外消毒設(shè)備；（3）消耗品：一次性手套、一次性帽子、加樣器吸頭（帶濾芯）；（4）專用工作服和工作鞋；（5）專用辦公用品。5.設(shè)備的維護保養(yǎng)應(yīng)當建立設(shè)備維護保養(yǎng)規(guī)程，計量設(shè)備應(yīng)當定

9、期檢定。例如核酸擴增儀、微量加樣器、生物安全柜、離心機應(yīng)當每年進行檢定或校準工作。（三）現(xiàn)場檢查工作流程及注意事項1.進入各工作區(qū)域應(yīng)當嚴格按照單一方向進行，即試劑儲存和準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)。2.各工作區(qū)域必須有明確的標記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用。 3.不同工作區(qū)域的工作服應(yīng)當加以區(qū)分，不得混用（例如可以采用不同顏色）。4.實驗室的清潔應(yīng)當按照試劑貯存和準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進行。不同的實驗區(qū)域應(yīng)當有其各自的清潔用具并防止交叉污染。實驗垃圾屬于醫(yī)療廢物的應(yīng)當按照醫(yī)療廢物管理條例相關(guān)規(guī)定進行處理。5.工作結(jié)束后，應(yīng)當立即對工作區(qū)進行清潔及

10、消毒。6.貯存試劑和用于標本制備的消耗品等材料應(yīng)當直接運送至試劑貯存和準備區(qū)，不能經(jīng)過擴增檢測區(qū)。應(yīng)當對加樣吸頭、PCR反應(yīng)管等消耗品處理，防止污染。試劑盒中的陽性對照品及質(zhì)控品應(yīng)當保存在標本處理區(qū)。試劑應(yīng)當使用分子生物學(xué)級別試劑，使用的純化水應(yīng)當高壓滅菌。質(zhì)檢用于原輔料、半成品、成品檢驗用的PCR反應(yīng)試劑應(yīng)當有相應(yīng)的質(zhì)量標準及操作程序。7.為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，應(yīng)當蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。應(yīng)當注意PCR反應(yīng)液加樣的順序，應(yīng)當為空白樣品陰性對照樣品陽性對照。對具有潛在傳染危險性的材料，應(yīng)當在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。8.應(yīng)當避免氣溶膠所致的污染，盡量減少在擴增區(qū)內(nèi)的走動，擴增反應(yīng)管不得在擴增區(qū)打開。9.擴增產(chǎn)物分析區(qū)有可能存在某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，應(yīng)當注意實驗人員的安全防護。（四）現(xiàn)場檢查人員培訓(xùn)情況參與PCR檢驗的工作人員應(yīng)當具備相應(yīng)的專業(yè)知識和技能，包括能熟練操作相關(guān)設(shè)備,明確整個工作的流程,掌握出現(xiàn)污染情況的處理方法以及實驗室質(zhì)量控制方法和檢測結(jié)果的解釋