補(bǔ)腎健脾法對(duì)卵巢早衰小鼠抑制素B含量及基因表達(dá)的影響

1、補(bǔ)腎健脾法對(duì)卵巢早衰小鼠抑制素B含量及基因表達(dá)的影響         作者：陳麗霞,張玉珍,徐發(fā)彬,林青梅,談海東,廖慧慧,黃曉利,梁曉云,趙燕 【摘要】 【目的】觀察補(bǔ)腎健脾法中藥復(fù)方對(duì)卵巢早衰（POF）小鼠抑制素B（INHB）含量及基因表達(dá)的影響?！痉椒ā窟x用雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、中藥預(yù)防組和中藥治療組。除正常               

2、0;   作者：陳麗霞,張玉珍,徐發(fā)彬,林青梅,談海東,廖慧慧,黃曉利,梁曉云,趙燕  【摘要】  【目的】觀察補(bǔ)腎健脾法中藥復(fù)方對(duì)卵巢早衰（POF）小鼠抑制素B（INHB）含量及基因表達(dá)的影響?！痉椒ā窟x用雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、中藥預(yù)防組和中藥治療組。除正常對(duì)照組外，其他3組采用SD大鼠卵巢抗原與弗氏佐劑注射免疫法復(fù)制自身免疫性卵巢功能衰退小鼠模型。中藥預(yù)防組于第1次免疫后開(kāi)始灌服中藥復(fù)方湯劑，連續(xù)17 d，中藥治療組于第3次免疫后開(kāi)始灌服中藥復(fù)方湯劑，連續(xù)5 d，劑量均為20 g·kg-1·d-1。采用酶

3、聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各組血清INHB含量，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）法檢測(cè)各組卵巢組織INHB mRNA表達(dá)水平，并觀察各組小鼠卵巢病理改變?！窘Y(jié)果】模型組小鼠血清INHB含量、卵巢組織INHB mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），光鏡下未見(jiàn)明顯生長(zhǎng)或成熟卵泡；中藥預(yù)防組血清INHB含量、卵巢組織INHB mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），卵泡數(shù)目略減少，無(wú)明顯病理改變；中藥治療組卵巢組織INHB mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P<0.05），而對(duì)血清INHB含量無(wú)影響（P>0.05），生長(zhǎng)成熟卵泡減少，且卵

4、巢組織出現(xiàn)病理改變。各組小鼠血清INHB含量與卵巢組織INHB mRNA表達(dá)變化呈相似趨勢(shì)，且中藥預(yù)防組作用優(yōu)于中藥治療組?！窘Y(jié)論】補(bǔ)腎健脾法中藥復(fù)方治療卵巢早衰的作用與其能增強(qiáng)卵巢組織INHB mRNA表達(dá)，升高INHB含量，改善卵巢的儲(chǔ)備功能有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  卵巢早衰/中藥療法；補(bǔ)腎健脾法；基因表達(dá)調(diào)控；卵巢/病理學(xué)；疾病模型，動(dòng)物；大鼠；小鼠 Abstract：ObjectiveTo probe the mechanism of the Chinese compound recipe, which has the actions of tonifying the kidne

5、y and strengthening the spleen, on inhibin B (INHB) content and its gene expression level in mice with immune premature ovarian failure (POF). MethodsFemale BALB/c mice were divided into 4 groups randomly: normal control group, model group, treatment group and prevention group. The autoimmune POF we

6、re induced in BALB/c mice except for the normal control group. Treatment group were treated with Chinese compound recipe (20 g·kg-1·d-1) for 5 continuous days after the third immunization, and prevention group were given Chinese compound recipe for 17 continuous days after the first immuni

7、zation. The mice serum INHB content was (Continued on page 591) 卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是引起卵巢功能衰退常見(jiàn)的疾病，其發(fā)病率在婦女中占1%3%,占繼發(fā)性閉經(jīng)的2%10%1,是當(dāng)今生殖醫(yī)學(xué)和生殖健康研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。研究認(rèn)為卵巢儲(chǔ)備功能低下的婦女,卵泡顆粒細(xì)胞抑制素的產(chǎn)生減少,不能將卵泡刺激素(FSH)抑制在正常范圍內(nèi),提示卵泡衰老2。維持卵泡完整性所需蛋白質(zhì)mRNAs的變化,預(yù)示凋亡過(guò)程的開(kāi)始3，而閉鎖過(guò)程是促進(jìn)或抑制凋亡的關(guān)鍵基因產(chǎn)物有序表達(dá)的結(jié)果4。臨床研究表明5補(bǔ)腎健脾中藥對(duì)卵

8、巢功能早衰患者具有較好療效。本研究觀察了補(bǔ)腎健脾中藥對(duì)POF小鼠抑制素B（INHB）及其基因表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。 1材料與方法 1.1動(dòng)物健康BALB/c小鼠,雌性,SPF級(jí),810周齡,體質(zhì)量1822 g；SD大鼠,雌性,SPF級(jí),體質(zhì)量約250 g，均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,大小鼠合格證號(hào)：0016889和0016888。 1.2主要試劑及儀器弗氏完全佐劑(CFA)和弗氏不完全佐劑(IFA)均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，小鼠INHB試劑盒為美國(guó)Rapid Bio Lab公司產(chǎn)品, Model 550 microplate reader為美國(guó)BioRad公司產(chǎn)品,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)?/p>

9、反應(yīng)(RTPCR)試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶均為北京索奧公司產(chǎn)品,GDS7600凝膠掃描系統(tǒng)(DF23B)為英國(guó)UVP公司產(chǎn)品,PE9700PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)PE公司產(chǎn)品。 1.3藥物補(bǔ)腎健脾法中藥復(fù)方由菟絲子、黨參、枸杞子、淮山、仙靈脾、女貞子、杜仲等組成,并制成濃縮液,含生藥1 g/L。 1.4卵巢抗原的制備收集SD雌性大鼠的卵巢組織,稱(chēng)質(zhì)量,洗凈,于TrisHCl緩沖液(pH 7.6、0.05 mmol/L，150 mmol/L NaCl，4 mmol/L乙二胺四乙酸，2 mmol/L檸檬酸，0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟)中剪碎并研磨成勻漿,低溫下超聲粉碎5 min,低溫離心(4 000 r/m

10、in×15 min,10 000 r/min×5 min)取上清,調(diào)整濃度為200 mg/mL,置于-20保存。 1.5自身免疫性卵巢功能衰退小鼠動(dòng)物模型復(fù)制 6免疫前通過(guò)陰道脫落細(xì)胞涂片篩選正常性周期小鼠，每只小鼠兩后腳掌和腹部多點(diǎn)皮下注射：10 mg(0.05 mL)卵巢抗原加CFA混合乳化液0.1 mL。首次免疫間隔1周,以卵巢抗原與IFA等量乳化加強(qiáng)免疫1次，5 d后再加強(qiáng)免疫1次。第3次免疫后5 d處死小鼠,摘眼球留取血清,收集卵巢組織,待檢測(cè)。 1.6分組及給藥將雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組,每組5只。正常對(duì)照組以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替卵巢抗原免疫,不灌

11、服藥物；模型組不灌服藥物；中藥預(yù)防組于第1次免疫后即開(kāi)始灌服中藥復(fù)方湯劑以預(yù)防POF的發(fā)生,劑量為20 g·kg-1·d-1,連續(xù)17 d；中藥治療組于第3次免疫后開(kāi)始灌服中藥復(fù)方湯劑,劑量為20 g·kg-1·d-1,連續(xù)5 d。 1.7取材及指標(biāo)檢測(cè)取血清采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(SandwichELISA)法檢測(cè)INHB水平；取卵巢組織采用RTPCR法檢測(cè)INHB mRNA的表達(dá),GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增。指標(biāo)檢測(cè)均參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。另取卵巢組織固定包埋切片染色后在光鏡下行組織病理學(xué)檢查。 1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟

12、件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 2結(jié)果 2.1各組小鼠的一般情況造模后各組均出現(xiàn)不同程度的活動(dòng)、攝食增加,略顯活躍,煩躁,攀爬噬咬鼠籠,毛松缺乏光澤較干枯,大便增多。 2.2各組小鼠造模前后陰道涂片觀察比較正常對(duì)照組小鼠陰道細(xì)胞涂片結(jié)果：動(dòng)情周期規(guī)律,可見(jiàn)大量角化細(xì)胞及羊齒狀結(jié)晶,細(xì)胞著色較深。免疫造模后小鼠陰道細(xì)胞涂片結(jié)果：模型組動(dòng)情期紊亂,細(xì)胞無(wú)周期性改變,上皮細(xì)胞體積明顯縮小,較幼稚,角化細(xì)胞和羊齒狀結(jié)晶明顯減少,漸消失，并逐漸被白細(xì)胞所代替。中藥治療組動(dòng)情期不典型,角化細(xì)胞和羊齒狀結(jié)晶亦減少。中藥預(yù)防組動(dòng)情間期延長(zhǎng),角化細(xì)胞和羊齒狀結(jié)晶略減少,細(xì)胞著色較正常組稍淡。 2.3各組小鼠卵巢病理改變?nèi)庋塾^

13、察見(jiàn)模型組卵巢體積較正常組卵巢縮小,雙角子宮變細(xì)長(zhǎng),部分卵巢與周?chē)尺B。光鏡檢查顯示：與正常對(duì)照組比較,中藥預(yù)防組卵泡數(shù)目略減少,余無(wú)明顯改變。中藥治療組除生長(zhǎng)成熟卵泡減少外,部分卵母細(xì)胞及透明帶形態(tài)異常,厚薄不均,扭曲,部分?jǐn)嗔?周邊顆粒細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則；閉鎖卵泡增多,且細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂。模型組未見(jiàn)明顯生長(zhǎng)或成熟卵泡(圖1，見(jiàn)彩圖頁(yè)第665頁(yè))。 2.4各組小鼠血清INHB含量比較表1結(jié)果顯示：模型組小鼠血清INHB含量顯著降低(P<0.05)，中藥預(yù)防組血清INHB含量顯著升高，與模型組及中藥治療組比較差異均有顯著性意義(P<0.05)，中藥治療組對(duì)血清INHB含量無(wú)影響(P>0.05)。表1各組小鼠血清INHB含量比較(略) 統(tǒng)計(jì)方法：?jiǎn)我蛩胤讲罘治?；P<0.05,與正常對(duì)照組比較；P<0.05,與模型組比較； P<0.05,與中藥治療組比較 2.5各組INHB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較表2、圖2結(jié)果顯示：小鼠卵巢組織INHB mRNA相對(duì)表達(dá)量模型組顯著降低(P<0.01)，中藥預(yù)防組與中藥治療組均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，且中藥預(yù)防組作用優(yōu)于中藥治療組(P<0.01)。表2各組INHB