兩種基于RAJI細胞的抗CD20單抗新型定量方法的比較及在藥物代謝動力學中的應(yīng)用

1、兩種基于RAJI細胞的抗CD20單抗新型定量方法的比較及在藥物代謝動力學中的應(yīng)用         11-04-22 16:20:00     編輯：studa20            作者：董增祥 王清清 陳立慧 侯盛 董立厚 王詩鴻 歐倫 劉秀文 宋海峰【摘要】  建立和比較基于RAJI細胞的流式細胞法(Flow cytometry assay

2、，F(xiàn)CA)和細胞放射免疫法(Immunoradiametric assay，IRA)測定重組抗CD20人源化單克隆抗體(rantiCD20zumAb)的濃度。兩種方法均利用標記后抗體和被檢測抗體競爭性結(jié)合RAJI細胞表面的CD20抗原，由標記后抗體的熒光或放射性變化而間接反應(yīng)檢測抗體的濃度。FCA和IRA定量范圍分別為0.1100 mg/L和0.0420 mg/L，F(xiàn)CA的日內(nèi)及日間精密度分別小于4.0%和3.0%，準確度為-1.7%1.1%，IRA的日內(nèi)及日間精密度值均小于7.0%，準確度為-8.9%13.2%。方法學確證研究表明，兩種方法均具有良好的特異性、靈敏度、精密度和準確度。血漿樣品

3、分析結(jié)果顯示，兩種方法具有良好的一致性，是檢測獼猴血漿中人源化單克隆抗體濃度的理想方法。 【關(guān)鍵詞】  重組抗CD20人源化單克隆抗體， 流式細胞法， 放射免疫法， 藥物代謝             1 引 言CD20抗原(人B淋巴細胞限制性分化抗原)是一種疏水性跨膜蛋白，分子量約為35 kDa，表達于前B細胞和成熟B細胞上，在90%以上的非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的B細胞上也有表達1,2。但是在造血干細胞、原B細胞、正常漿細胞或其它正常組織未發(fā)現(xiàn)表達。CD20抗原

4、不從細胞表面脫落，且與抗體結(jié)合后不發(fā)生內(nèi)化，循環(huán)中未發(fā)現(xiàn)游離CD20抗原，CD20可作為靶位點與抗體結(jié)合用于治療腫瘤35。重組抗CD20人源化單克隆抗體(rhantiCD20zumab，RACD20)是一個靶向CD20抗原，由人鼠嵌合抗體人源化改造而來，與抗CD20嵌合抗體美羅華(RituximAb)相似，通過多種機制產(chǎn)生殺傷腫瘤細胞作用。其一是直接作用，包括補體依賴的細胞毒作用(CDC)和抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(ADCC);其二是間接作用，包括促進細胞結(jié)構(gòu)改變、誘導調(diào)亡和提高細胞對細胞毒性藥物的敏感性等68。該抗原主要適用于非霍奇金氏淋巴瘤。RACD20有效作用的發(fā)揮依賴于它能夠到達

5、腫瘤細胞的多少，因此準確測定靜脈滴注RACD20后病人血中的藥物濃度，對于制訂合理的給藥方案具有一定的指導意義。目前，測定RACD20的方法很少，主要針對RituximAb采用的是酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)911，但是由于沒有商品化的試劑盒，在采用ELISA時需要合成較多試劑，操作過程復雜、費時、費力?；诩毎砻婵乖瓉矶繖z測生物基質(zhì)中的抗體具有一定的優(yōu)勢：可以針對抗體藥物選擇含有特定抗原的細胞從而提高特異性;可以在定量分析的同時進行定性的機制分析，而且分析過程操做簡單、快速、準確。本研究采用細胞表面表達大量CD20抗原的RAJI細胞12，建立了基于RAJI細胞的RACD20的流式細胞

6、法和放射免疫法，利用標記后RACD20和被檢測RACD20競爭性結(jié)合RAJI細胞表面的CD20抗原，由標記后抗體的熒光或放射性變化而間接反應(yīng)被檢測抗體的濃度。分別進行了兩種方法的方法學確證，并比較了兩種方法在方法學及測定獼猴血漿樣品上的優(yōu)缺點。2 實驗部分2.1 儀器與試劑流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司);Wallac1470 計數(shù)儀(美國PerkinElmerTM公司);HP1100四元泵液相系統(tǒng)(美國Agilent公司);RadiomaticTM 525TR型流式液閃儀(美國Packard公司);Heraeus培養(yǎng)箱(上海賀利氏公司);超純水系統(tǒng)(美國MILLIPOR

7、E公司);TLLC高速臺式離心機(北京四環(huán)儀器廠);微量振蕩器(國華電器有限公司);微量加樣器(美國Gilson公司)。RACD20(純度> 98.0%，上海中信國健藥業(yè)有限公司);異硫氰酸熒光素(FITC，上海中信國健藥業(yè)有限公司);Na125I (PerkinElmerTM公司)，放化純度為99.0%，放射核素純度為99.9%，比放射活度為643.8 GBq/mg Iodide;Iodogen試劑，即1,3,4,6四氯3,6二苯基脲(美國Sigma公司);125I標記的RACD20(純度> 98.0%，自制);RAJI細胞(上海中信國健藥業(yè)有限公司)。實驗用水為二次蒸餾水。獼猴

8、血漿樣品的采集：每組健康雌性獼猴2只，健康雄性獼猴1只，RACD20 10 mg/kg于0.5 h內(nèi)在獼猴后肢外側(cè)靜脈滴注完畢，于給藥前和給藥藥后30 min，1，2，4，8，12，24，36 h，2，3，4，5，6，7，8，9，10 d在注射對側(cè)后肢靜脈取血0.8 mL于EDTA抗凝管中，離心分離得血漿，樣品于-80 保存待測。2.2 實驗步驟2.2.1 FITCRACD20的制備和純化 以25 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.0)將欲標記抗體稀釋成1.0%濃度，裝入透析袋中。用上述緩沖液將配制0.1 g/L FITC溶液，將透析袋浸沒于10倍抗體溶液體積的FITC液中，在4 電磁攪拌下透

9、析標記24 h。取出透析袋中標記液，用Sephadex G50凝膠純化去除游離熒光素，分裝后貯存于4 冰箱中待用。2.2.2 125IRACD20的制備和純化 采用Iodogen法標記RACD20。稱取1 mg Iodogen試劑溶于0.5 mL氯仿中，取50 L加至試管底部，用氮氣吹干，加入2 mL RACD20 20 mg，加入51 MBq Na125I，室溫振蕩反應(yīng)12 min。將上述標記混合物加在50 cm×1 cm的Sephacryl S200 HR凝膠柱上分離純化。洗脫液為0.02 mol/L檸檬酸三鈉(含0.2 mol/L NaCl，pH 7.2)，流速12 mL/h，

10、分步收集洗脫液，用Wallac1470 計數(shù)儀測定洗脫液的放射性計數(shù)。在放射性峰處同時監(jiān)測蛋白濃度。經(jīng)凝膠柱純化后的樣品用高效液相色譜法鑒定放射性化學純度。125IRACD20的放射性化學純度>98%。分 析 化 學第37卷第10期董增祥等：兩種基于RAJI細胞的抗CD20單抗新型定量方法的比較及在藥物代謝動力學中的應(yīng)用 2.2.3 RAJI細胞的制備和固定 采用甲醛Triton X法固定RAJI細胞以。取對數(shù)生長期的RAJI細胞，離心，用PBS洗滌一次，加入4 預冷的0.5%甲醛PBS溶液34 mL，4 固定30 min以上。經(jīng)1000 r/min離心10 min后，用PBA(含0.1

11、%疊氮鈉，0.1% BSA的PBS溶液)溶液洗滌一次。在4 用2 mL 0.1% Triton X100PBS溶液處理3 min。1000 r/min離心10 min，用含1% BSA的PBS溶液洗滌一次，離心，以RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整至適當?shù)募毎麧舛取?.2.4 流式細胞法測定RACD20標準曲線制備和樣品前處理 用PBS將RACD20標準品稀釋至400 mg/L，然后連續(xù)兩倍倍比稀釋至0.05 mg/L13，即標準濃度為200，100，50，25，12.50，6.25，3.20，1.60，0.80，0.40，0.20，0.10和0.05 mg/L。各濃度的標準品加入等體積10 mg/L

12、的FITCRACD20。實際樣品測定時，用PBS將待測定樣品中抗CD20抗體濃度按一定倍數(shù)稀釋至標準曲線范圍內(nèi)，加入等體積10 mg/L FITCRACD20。取對數(shù)生長期的RAJI細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度至2×106/mL，然后將細胞懸液分至流式專用管中，100 L/管。將標準品的序列稀釋液及待測樣品加入分好細胞懸液的流式管中，100 L/管，每一濃度設(shè)2個復管，PBS為空白對照，冰浴避光45 min。PBS洗滌細胞2次，2000 r/min離心5 min，重懸于300 L PBS中。流式細胞儀測定熒光強度MCF(Mean channel fluorescence)。2.2.5 放

13、射免疫法測定RACD20標準曲線制備和樣品前處理 用PBS將RACD20標準品稀釋至80 mg/L，然后連續(xù)兩倍比稀釋至0.02 mg/L，即標準濃度為40，20，10，5，2.50，1.25，0.60，0.30，0.15，0.08，0.04及0.02 mg/L。每個濃度的標準品加入等體積30 mg/L的125IRACD20。實際樣品測定時，用PBS將待測定樣品中抗CD20抗體濃度按一定倍數(shù)稀釋至標準曲線范圍內(nèi)，加入等體積30 mg/L的125IRACD20。取對數(shù)生長期的RAJI細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度至2×106/mL，然后將細胞懸液分至計數(shù)儀專用管中，100 L/管。將標準品的

14、序列稀釋液及待測樣品加入分好細胞懸液的管中，100 L/管，每一濃度設(shè)兩個復管，PBS為空白對照，冰浴避光45min。PBS洗滌細胞兩次，2000 r/min離心5 min，重懸于300 L PBS中。Wallac1470 計數(shù)儀測定放射性計數(shù)CPM(counts)。2.2.6 結(jié)果計算 用MicroCal公司Origin 5.0軟件對濃度對數(shù)X和各管樣品響應(yīng)值Y(FCA為MCF，IRA為CPM)繪制標準曲線，四參數(shù)Logistic擬合：Y=(Emax-Emin)(1+(X/EC50)slope)+Emin其中，Emax和Emin分別為S形曲線的最大值和最小值;EC50為50%響應(yīng)值對應(yīng)的濃度;Slope為斜率，即響應(yīng)值隨RACD20濃度的變化率。用同一批次設(shè)置的標準曲線，計算樣品中RACD20濃度。3 結(jié)果與討論3.1 方法的選擇目前，檢測Rituximab濃度的方法主要為ELISA，使用多抗14,15或單抗16,17針對Rituximab結(jié)構(gòu)中來源于鼠的FV片段直接結(jié)合，過程復雜。已有文獻報道使用流式細胞儀來檢測與CD52結(jié)合的抗體CAMPATH1H 的濃度18。本研究采用細胞表面表達大量CD20抗原的RAJI細胞，建立了基于RAJI細胞的RACD20的測定方法：流式細胞法和放射免疫法。3.2 方法的評價3.2.1 特異性 與正