α2纖溶酶抑制物和PAP檢測(cè)方法的建立

1、    2纖溶酶抑制物和PAP檢測(cè)方法的建立        2抗纖溶酶(2PI）和2抗纖溶酶-纖溶酶復(fù)合物(PAP)的改變與血栓性疾病1、DIC、惡性腫瘤等許多疾病相關(guān)聯(lián)，這兩個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)對(duì)于了解血液系統(tǒng)的纖溶改變有重要意義。我們建立了這兩個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)方法，并對(duì)它們的特異性、敏感性等進(jìn)行了探討。 材料和方法1辣根過(guò)氧化物酶(HRP)為Sigma公司產(chǎn)品，純化的2PI蛋白、兔抗人纖溶酶原多抗為法國(guó)Stago公司產(chǎn)品，PAP復(fù)合物標(biāo)準(zhǔn)品為日本Aoki教授惠贈(zèng)。2單克隆抗體(單抗)

2、的制備按常規(guī)方法。3鑒定單抗抗原結(jié)合位點(diǎn)采用Western blot技術(shù)。4單抗對(duì)抗原活性的影響單抗與抗原于37共溫育30分鐘，4過(guò)夜，離心取上清液發(fā)色底物法檢測(cè)抗原2PI抑制纖溶酶的活性。5雙抗體夾心法檢測(cè)2PI的方法建立將抗2PI單抗CH-2用包被液(pH 9.6,0.05mmol/L碳酸鹽緩沖液)稀釋至5g/ml包板，4孵育過(guò)夜后用封閉液(含體積分?jǐn)?shù)為3的BSA的PBS)封閉；用稀釋液(含10g/L的BSA及體積分?jǐn)?shù)為0.1%的Tween-20的PBS)將待測(cè)血漿稀釋200倍后加入已包被抗體的酶標(biāo)板，0.1ml/孔，用將2PI標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)倍稀釋后加入酶標(biāo)板在492nm處的吸光度(A492)作

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)判斷待測(cè)樣本2PI的含量。6雙抗體夾心法檢測(cè)PAP復(fù)合物方法的建立將抗Plg多克隆抗體作為固相抗體，10g/ml包板，用HRP標(biāo)記的CH-7作為液相抗體，其余同2PI檢測(cè)。7方法學(xué)評(píng)價(jià)各取5份已知2PI和PAP濃度的血漿標(biāo)本于同一批內(nèi)測(cè)定10次，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)；在不同檢測(cè)日測(cè)定10次，計(jì)算批間誤差；再取2份已知2PI和PAP濃度的血漿標(biāo)本，加入一定量的2PI和PAP純品，測(cè)定2PI和PAP的含量，計(jì)算回收率；將2PI和PAP標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)倍稀釋后作線(xiàn)性相關(guān)分析。8病例選擇正常對(duì)照組58名，男女各半，年齡2055歲，平均年齡34歲；患者組為肝臟疾病90例；急性非淋巴細(xì)胞白血病

4、(ANLL)70例；缺血性腦血管病15例。結(jié)果1單抗特性CH-2為IgG 2a型，其腹水效價(jià)達(dá)5×10-6; CH-7為IgG 1型，其腹水效價(jià)為1×10-7; 純化后單抗在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶;雜交瘤細(xì)胞株的染色體數(shù)為98條左右。2單抗CH-2、CH-7特性的鑒定Western blot 顯示，用單抗CH-2雜交可顯示正常人血漿泳道中的一條相對(duì)分子質(zhì)量為67×103的條帶，為2PI；在含PAP而無(wú)2PI的血漿中未出現(xiàn)任何條帶。而單抗CH-7雜交在正常血漿中亦顯示相對(duì)分子質(zhì)量為67×103附近的一條帶，但在含PAP的血漿中則顯示出相對(duì)分子質(zhì)量為

5、150×103附近的一條帶，此為PAP復(fù)合物，而相對(duì)分子質(zhì)量為67×103的條帶消失。我們用純化的2PI及PAP復(fù)合物亦得到同樣的結(jié)果。3單抗對(duì)抗原活性的影響單抗CH-2共孵育的抗原2 PI活性下降，而且隨著抗體量的增加，其活性下降幅度增大，呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)關(guān)系；而與單抗CH-7共孵育的抗原活性?xún)H輕微改變(1)。     1不同濃度的單抗對(duì)2PI抑制纖溶酶活性的影響4抗Plg多抗特性的鑒定瓊脂雙擴(kuò)散結(jié)果顯示，抗Plg多抗可以和PAP復(fù)合物形成肉眼可見(jiàn)的沉淀線(xiàn)，說(shuō)明抗Plg多抗可以和PAP復(fù)合物結(jié)合。52PI及PAP復(fù)合物檢測(cè)方法的建立2

6、PI的雙抗體夾心ELISA法批內(nèi)誤差為4.3%，批間誤差為7.5%，回收率為98.0%，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.9992，線(xiàn)性檢測(cè)范圍為580ng/ml。PAP復(fù)合物的雙抗體夾心ELISA法批內(nèi)誤差為4.6%，批間誤差為4.0%，回收率為92.4%，相關(guān)系數(shù)為0.9972，線(xiàn)性檢測(cè)范圍為350ng/ml。62PI及PAP復(fù)合物檢測(cè)的臨床應(yīng)用見(jiàn)表1。討 論我們運(yùn)用常規(guī)免疫方法制備了2PI單抗CH-2、CH-7，單抗CH-2只可以與野生型游離2PI(相對(duì)分子質(zhì)量為67×103)結(jié)合，而不能與PAP(相對(duì)分子質(zhì)量為150×103)結(jié)合；而CH-7既可以與游離2PI結(jié)合，又可以與PAP結(jié)

7、合。表12PI 、PAP復(fù)合物在正常人及各類(lèi)疾病中的改變組別例數(shù)2PI(mg/L)PAP(mg/L)正常成人5866.9±15.40.59±0.13ANLL組初診期3052.1±17.11.78±1.08化療后2562.5±15.21.24±1.05緩解期1570.2±19.70.66±0.21肝臟疾病組9025.1±29.40.74±0.29急性肝炎3034.1±24.90.71±0.09慢性肝炎2023.5±10.50.75±0.25肝硬化2520.3

8、±18.00.76±0.14重癥肝炎1517.4±24.90.75±0.19缺血性腦病1523.4±9.91.09±0.45     注：與正常成人組比較，P<0.01， * P<0.05；化療后與化療前比較，#P<0.05 國(guó)內(nèi)現(xiàn)有檢測(cè)2PI抗原的方法有火箭電泳法、免疫擴(kuò)散法、ELISA法等，它們均建立在多克隆抗體的基礎(chǔ)上，所以檢測(cè)出的結(jié)果不僅包括游離的2PI還包括PAP。在DIC、溶栓治療等患者中，血漿PAP水平顯著上升，它干擾了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，不能準(zhǔn)確判斷患者的真實(shí)游離

9、2PI的水平。我們用CH-2作為固相抗體，用不與PAP結(jié)合的CH-7作為液相抗體建立的ELISA法可檢測(cè)游離2PI，不受PAP的影響。這兩個(gè)指標(biāo)可以用于了解這些患者的纖溶異常狀態(tài)，闡明纖溶改變與臨床出血癥狀和疾病病情變化的關(guān)系，尤其PAP在評(píng)價(jià)存在肝功能受損患者的纖溶狀態(tài)時(shí)更為有用2?；痦?xiàng)目:本課題受胡應(yīng)洲基金部分資助作者單位：儲(chǔ)海燕王鴻利王學(xué)鋒王振義200025上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學(xué)研究所參考文獻(xiàn)1Kario K, Matsuo T, Kodana K, et al. Clinical revelevance of determination of plasma AT and 2-antiplasmin activities in patients with DIC application of the molecular markers for the analysis of pathophysiology of DIC. Rinsloo Byori, 1994, 42:45.2Vukovic