p16基因異常與慢性粒細(xì)胞白血病關(guān)系的研究

1、    p16基因異常與慢性粒細(xì)胞白血病關(guān)系的研究        我們采用半定量多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)檢測了48例慢性粒細(xì)胞白血病(CML)患者p16基因純合缺失和點(diǎn)突變，以期從分子生物學(xué)水平探討p16基因分子生物學(xué)異常與CML的關(guān)系。 對象和方法1對象12名正常人，男性7名，女性5名，平均年齡31.6歲。48例CML患者,其中慢性期20例，急粒變16例，急淋變12例(所有病例原始淋巴細(xì)胞+幼稚淋巴細(xì)胞0.20，組織化學(xué)染色都表現(xiàn)為糖原

2、染色過碘酸反應(yīng)強(qiáng)陽性，POX陰性),男性33例，女性15例,平均年齡33.6歲。K562細(xì)胞株為p16基因純合缺失，作為p16基因缺失的陽性對照。凝血因子外顯子4(E4)為內(nèi)對照。引物由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所合成，其序列見表1。表1不同基因外顯子的引物序列基因引物序列產(chǎn)物長度(bp)p16基因E15-GAAGAAAGAGGAGGGGCTG-33365-GCGCTACCTGATTCCAATTC-3p16基因E25-GCTCTACACAAGCTTCCTTTCC-33935-ACGAATTCTCAGATCATCAGTCC-3凝血因子5-CCAATGAGTATCTACAGGGG-3273基因E4

3、5-TACACCAATATTGCATTTTC-3     2方法2.1DNA提?。喝」撬杌蛲庵苎? ml，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液離心收集單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，常規(guī)方法提取DNA，并進(jìn)行濃度和純度測定。2.2半定量多重PCR檢測p16基因純合缺失：將E1或E2和E4放在一個(gè)體系中進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積50 l，含1.5 U DNA聚合酶，DNA 200 ng，E1、E2、E4引物量分別為25 pmol、25 pmol、50 pmol。PCR循環(huán)條件：E1+E4： 94 1分鐘，58 1分鐘，72 1.5分鐘；E2+E4： 94 1分鐘，56 1

4、分鐘，72 1.5分鐘，兩者均為35個(gè)循環(huán)，DNA擴(kuò)增產(chǎn)物先經(jīng)20 g/L瓊脂糖電泳、紫外燈下照相，負(fù)片再送TCL薄層掃描儀掃描，測出兩條產(chǎn)物帶的吸光度(A)值，計(jì)算比值。正常人應(yīng)擴(kuò)增出兩條帶，第1條為內(nèi)對照凝血因子基因E4擴(kuò)增產(chǎn)物，其長度為273 bp，第2條帶為p16基因E1或E2擴(kuò)增產(chǎn)物，長度為336 bp或393 bp。其比值用即A1/A4或A2/A4(A1、A2、A4分別代表p16基因E1、p16基因E2、凝血因子基因E4擴(kuò)增產(chǎn)物吸光度掃描值)表示。再以3倍K562細(xì)胞DNA和1倍正常人細(xì)胞DNA多次混合擴(kuò)增的比值的平均值(<"9903031.jpg (732 字節(jié))

5、" src="/med/cano/201003/20100317171122380.jpg" 15 17>1=A1/A2,<"9903031.jpg (732 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100317171122380.jpg" 15 17>2=A2/A4)作為p16基因純合缺失的標(biāo)準(zhǔn)值，本實(shí)驗(yàn)測得的<"9903031.jpg (732 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100317171122380.jpg"

6、; 15 17>1=1.1716±0.0913、<"9903031.jpg (732 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100317171122380.jpg" 15 17>2=1.1680±0.0841。其判斷方法參考Sill等方法1。如患者的基因擴(kuò)增后測得的A1A4（A2A4）小于<"9903031.jpg (732 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100317171122380.jpg" 15 17>1（<

7、;"9903031.jpg (732 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100317171122380.jpg" 15 17>2)，則可認(rèn)為此例患者屬p16基因E1(E2)純合缺失。2.3p16基因E1和E2 PCR-SSCP分析：先進(jìn)行p16基因單個(gè)外顯子PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體積50 l，含1.5 U Taq DNA酶，DNA 200 ng,E1、E2引物量均為25 pmol。PCR循環(huán)條件：E1：94 1分鐘，58 1分鐘，72 1.5分鐘；E2：94 1分鐘，56 1分鐘，72 1.5分鐘，兩者均35個(gè)循環(huán)，開始97 變

8、性8分鐘，結(jié)尾72 延伸5分鐘。擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺垂直電泳、銀染，觀察電泳帶變化，確定有無異常發(fā)生。3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用四格表2檢驗(yàn)和四格表確切概率計(jì)算法。 結(jié)果1正常人和CML患者p16基因純合缺失的檢測結(jié)果(見1)12名正常人均無p16基因E1和E2純合缺失。48例CML患者共有9例發(fā)生缺失，且E1和E2同時(shí)發(fā)生缺失。     M：分子量標(biāo)準(zhǔn)；19：9例CML患者19例CML患者p16基因E2多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳如1所示，擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)兩條帶，第1條帶為因子基因E4擴(kuò)增產(chǎn)物，其長度為273 bp，第2條帶為p16基因E2擴(kuò)增產(chǎn)物，其長度為393 b

9、p。例2、例3、例9的A1/As(A2/As)比值小于<"9903031.jpg (732 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100317171122380.jpg" 15 17>1(<"9903031.jpg (732 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100317171122380.jpg" 15 17>2)，則可認(rèn)為這3例患者屬p16基因E2純合缺失。2CML患者p16基因點(diǎn)突變的檢測對12名正常人和39例CML患者(48例除外9例p16

10、基因純合缺失)進(jìn)行PCR-SSCP分析，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)有點(diǎn)突變發(fā)生。部分病例SSCP分析見2。     M:分子量標(biāo)準(zhǔn)；N1、N2：正常人2部分CML患者p16基因PCR-SSCP電泳討論本組48例CML患者中，只有急淋變組與正常人組比較p16基因純合缺失差異顯著，而慢性期組和急粒變組與正常人比較差異均無顯著性。Ogawa等2報(bào)道CML慢性期p16基因純合缺失率也很低，Sill等1發(fā)現(xiàn)50%的急性淋巴細(xì)胞白血病患者有p16基因純合缺失，Serra等3在17例急性期CML病例中，檢出3例有p16基因純合缺失，且3例均為急淋變病例。這些結(jié)果提示p16基因純合缺

11、失與CML發(fā)生及急粒變關(guān)系不大，但與CML急淋變存在著密切的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，在8例急淋變p16基因純合缺失病例中，有3例是在急變前就已發(fā)生p16基因純合缺失，最早的1例發(fā)生在急變前3個(gè)月。p16基因純合缺失與CML急淋變關(guān)系密切，其機(jī)制尚不清楚。目前認(rèn)為，淋巴細(xì)胞內(nèi)存在著某些特殊機(jī)制(如DNA重組酶活性增高)，如果p16基因發(fā)生純合缺失，細(xì)胞內(nèi)缺乏p16蛋白競爭的CDK活性就增強(qiáng)，從而淋巴細(xì)胞性腫瘤增殖加快，而粒系腫瘤細(xì)胞增殖減慢，在細(xì)胞永生化的過程中淋巴細(xì)胞性腫瘤獲得優(yōu)勢，最終演變?yōu)榧绷茏?。我們?2名正常人和39例CML患者中未發(fā)現(xiàn)有p16基因點(diǎn)突變，Ogawa等2也報(bào)道p16基因

12、點(diǎn)突變在CML中很少發(fā)生?？傊?，CML p16基因點(diǎn)突變是一個(gè)較低概率的事件，其分子生物學(xué)異常主要是p16基因純合缺失。臨床上，利用部分CML患者在急淋變前就已發(fā)生p16基因純合缺失這一特點(diǎn)，檢測p16基因純合缺失就可預(yù)測部分CML患者發(fā)生急淋變，就可在急淋變前及時(shí)采取有效治療措施如強(qiáng)烈聯(lián)合化療或骨髓移植，以提高治愈率。作者單位：510080廣州，中山醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科參考文獻(xiàn)1Sill H, Goldman JM, Cross NC, et al. Homozygous deletions of the p16 tumor suppressor gene are associated

13、 with lymphoid transformation of chronic myeloid leukemia. Blood, 1995, 85:2013-2016.2Ogawa S, Hangaishi A, Miyawaki S, et al. Loss of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor (p16, MTS1) gene is frequent in and highlyspecific to lymphoid tumors in primary haematopoietic malignancies. Blood, 1994, 84:3122-3126.3Serra A, Gottardi E, Della F, et a