H-2Kb基因轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)小鼠心肌移植免疫耐受

1、    H-2Kb基因轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)小鼠心肌移植免疫耐受        摘要：目的探討H-2Kb基因轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)小鼠心肌移植免疫耐受的可行性。方法通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將供體小鼠（C57 BL6）的H-2Kb基因（小鼠MHC-類基因）導(dǎo)入到受體小鼠（BALBc）的造血細(xì)胞。結(jié)果H-2Kb基因可以穩(wěn)定地整合進(jìn)小鼠造血細(xì)胞的基因內(nèi)，并在受體內(nèi)表達(dá)較長(zhǎng)時(shí)間。正常對(duì)照小鼠的心肌移植物平均存活時(shí)間（MST）為9.4±1.84d。誘導(dǎo)耐受組小鼠的心肌移植物MST為45.7

2、±6.001d，比對(duì)照組明顯延長(zhǎng)（P0.05）。結(jié)論H-2Kb基因轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)了供體特異性的免疫耐受，為臨床移植控制排斥反應(yīng)提供了一種新的方法。關(guān)鍵詞：基因轉(zhuǎn)移；小鼠；移植；免疫耐受中分類號(hào)：R392.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：AInduction of myocardium transplantation tolerance by H-2Kb gene transfer in miceLI ZhenXU Hong-xuZENG Wen-taoCHEN Gui-hua（Laboratory of Surgery， the First Affiliated Hospital， Sun Yat-Sen

3、University of Medical Sciences， Guangzhou 510080，China)LI Shu-nong(Department of Pathophysiology，Sun Yat-Sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510089，China)ZHU Zhen-yu(Department of Biochemistry，Sun Yat-Sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510089，China）Abstract：ObjectiveTo look for th

4、e effect of H-2Kb gene transfer on myocardium transplantation tolerance in mice.MethodsH-2Kb gene of donor mouse（C57BL6）was transferred into the recipient（BALBc）murine hematopoietic cells by retrovirus-mediated gene transfer technique.ResultsH-2Kb gene could be transferred into murine hematopoietic

5、cells successfully，and it can express stably long in the recipient mice.The median survival time（MST）of heart graft in the induced tolerance group was significantly longer than that of the control group（45.7±6.001 days vs 9.4±1.84 days， P0.05）. ConclusionDonor-specific immune tolerance to

6、allograft has been induced by H-2Kb gene transfer.This may provide a novel way for inhibiting transplantation rejection in clinical transplantation.Key words：gene transfer；mouse；transplantation；immune tolerance器官移植的主要障礙是由于供受者之間主要組織相容性復(fù)合體（majorhistocompatibilitycomplex，MHC）的差異所引起的免疫排斥反應(yīng)。臨床上主要應(yīng)用大劑量的免疫

7、抑制劑來控制排斥反應(yīng)，但這樣也降低了機(jī)體對(duì)感染和腫瘤等的抵抗力。解決這一難題的有效途徑，是誘導(dǎo)受體對(duì)供體組織抗原產(chǎn)生特異性免疫耐受1。本研究應(yīng)用分子克隆技術(shù)，將供體小鼠H-2Kb基因?qū)胧荏w小鼠的造血細(xì)胞，并用小鼠心肌移植的模型，初步探討了通過H-2Kb基因轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)移植免疫耐受的可行性。1材料和方法1.1動(dòng)物BALBc（H-2d）、C57BL6（H-2b）、CBAJ（H-2K）近交系小鼠，810周齡，1822g，雌雄兼用，由中山醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2試劑脂質(zhì)體（lipofectin）、G418（geneticin）、限制性內(nèi)切酶和RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司。AMV逆轉(zhuǎn)

8、錄酶購(gòu)自Promega公司。PBR322 DNAHinf Marker、pGEM-7zf Hae DNA Marker、PCR markers購(gòu)自華美生物工程公司。FITC標(biāo)記抗小鼠H-2Kb單克隆抗體購(gòu)自Pharmingen公司。1.3質(zhì)粒pXN（N2-B19-H-2Kb cDNA）和空載體N2由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院SANDRADOREN博士惠贈(zèng)。1.4儀器PCR儀（型號(hào)PTC-150，美國(guó)MJ-Research公司產(chǎn)品）。流式細(xì)胞儀（型號(hào)EPICS ELITE，美國(guó)Coulter公司產(chǎn)品）。心電機(jī)（XDH-3B型，上海醫(yī)用電子儀器廠）。1.5質(zhì)粒DNA的提取、酶切鑒定和純化按文獻(xiàn)2進(jìn)行。參照

9、lipofectin說明書用脂質(zhì)體介導(dǎo)H-2Kb基因轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PA317。篩選抗性克隆并測(cè)定病毒滴度3。1.6BALBc小鼠造血細(xì)胞的感染4及其目的基因的檢測(cè)分別提取小鼠造血細(xì)胞的DNA、RNA，用相應(yīng)的基因特異引物進(jìn)行PCR和RT-PCR2。1.7H-2kb抗原表達(dá)的檢測(cè)用FITC標(biāo)記的抗小鼠H-2Kb單克隆抗體分別標(biāo)記感染及未感染的小鼠造血細(xì)胞（培養(yǎng)5d），用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其H-2Kb抗原的表達(dá)。1.8轉(zhuǎn)移的H-2Kb基因在受體內(nèi)的較長(zhǎng)期表達(dá)受體BALBc小鼠以60Co 射線8.0Gy全身照射后，4h內(nèi)由尾靜脈輸入轉(zhuǎn)導(dǎo)H-2Kb基因或空載體的BALBc小鼠骨髓細(xì)胞懸液0.2ml只（濃度為

10、1.5×107ml）。在2、8、12周，用PCR動(dòng)態(tài)檢測(cè)導(dǎo)入的基因在受體內(nèi)的表達(dá)。1.9小鼠耳后心肌移植在受體小鼠（BALBc，H-2Kb陰性）回輸表達(dá)H-2Kb基因的造血細(xì)胞2周后，進(jìn)行小鼠耳后心肌移植，觀察其存活時(shí)間。參照BABANG等的方法5稍加修改。術(shù)后第5d起，在乙醚麻醉下用心電機(jī)測(cè)錄移植心肌的心電活動(dòng)。如術(shù)后8d仍未出現(xiàn)心電，則為移植手術(shù)失敗，不列入實(shí)驗(yàn)觀察數(shù)據(jù)。以心電活動(dòng)消失日作為排斥終點(diǎn)，并進(jìn)行移植心肌的病理觀察。1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示。多組間比較采用方差分析及Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。顯著性檢驗(yàn)采用雙側(cè)檢

11、驗(yàn)，所有計(jì)算采用SPSS forWindows軟件在微型計(jì)算機(jī)上進(jìn)行。2結(jié)果2.1抗性克隆的篩選及病毒滴度用脂質(zhì)體將pXN質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染PA317細(xì)胞，48h后加300gml G418進(jìn)行選擇培養(yǎng)。2d后細(xì)胞開始死亡，10d后大部分細(xì)胞死亡，僅見散在的抗G418細(xì)胞團(tuán)。2周后逐漸形成肉眼可見的抗性細(xì)胞克隆。所得病毒滴度最高可達(dá)2.2×106CFUml。2.2轉(zhuǎn)染后小鼠造血細(xì)胞中目的基因的檢測(cè)2.2.1PCR檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后小鼠造血細(xì)胞的DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為274bp，說明其整合了H-2Kb cDNA基因（見1）。1PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig1Agarose gel electr

12、ophoresis of the PCR product1：N2-vector infected mice hematopoietic cells2：non-infected mice hematopoietic cellsM：PBR322DNAHinf I Marker3：infected mice hematopoietic cells4：G418-resistant PA317H-2Kb cell clone2.2.2RT-PCR檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后小鼠造血細(xì)胞的RNA RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為409bp，是從H-2Kb mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA片段。說明其整合了H-2Kb cDNA基因，且可以轉(zhuǎn)

13、錄為mRNA（見2）。2RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig2Agarose gel electrophoresis of the RT-PCR productM：PGEM-7Zf Hae DNA Marker1：N2-vector infected mice hematopoietic cells2：infected mice hematopoietic cells3：G418-resistant PA317H-2Kb cell clone4：non-infected mice hematopoietic cells2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)H-2Kb抗原的表達(dá)空載體轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的BALBc小鼠

14、造血細(xì)胞的非特異性熒光染色為1.6，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染后表達(dá)H-2Kb抗原的BALBc小鼠造血細(xì)胞為43.2。說明其細(xì)胞膜上有H-2Kb抗原的表達(dá)。2.4導(dǎo)入的H-2Kb基因在受體內(nèi)的較長(zhǎng)期表達(dá)輸注細(xì)胞2、8、12周后，輸入已轉(zhuǎn)導(dǎo)H-2Kb基因造血細(xì)胞的受體BALBc小鼠，其骨髓細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為274bp，而空載體轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的受體BALBc小鼠結(jié)果為陰性（見3）。3PCR檢測(cè)H-2Kb基因在受體內(nèi)的表達(dá)Fig3Expression of H-2Kb gene in recipientM：PBR322 DNAHinf Marker 1：C57BL62：non-infected BA

15、LBc3：12 weeks post-transplantation4：8 weeks post-transplantation5：N2-vector infectedBALBc6：2 weeks post-transplantation2.5H-2Kb基因轉(zhuǎn)移對(duì)小鼠心肌移植物存活時(shí)間的影響重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染組的移植心肌存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，與其它組比較，有顯著性差異（P0.05）。且正常排斥第三供體CBAJ小鼠（P0.05）。而空載體轉(zhuǎn)染組、第三供體組的移植心肌平均存活時(shí)間（MST）與未轉(zhuǎn)染組比較，無顯著性差異（P0.05）（見表1）。表1H-2Kb基因轉(zhuǎn)移對(duì)小鼠心肌移植的作用（n10）Ta

16、b1The effect of H-2Kb gene transfer on murine myocardium transplantationGroupDonorRecipientSurvival time of the graft（days）（s）AC57BL6BALBc9.4±1.84BC57BL6BALBc（transfection with N2）8.8±1.48CC57BL6BALBc（transfection with pXN）45.7±6.001DCBAJBALBc（transfection with pXN）9.3±1.64ECBAJB

17、ALBc（transfection with N2）9.2±1.55FCBAJBALBc9.6±1.71*P0.05，compared with other groupsP0.05，compared with B and F；E and F or F respectively 2.6移植心肌的組織學(xué)改變?cè)谖崔D(zhuǎn)染組心電活動(dòng)終點(diǎn)（約第9d），未轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組及第三供體組的移植心肌細(xì)胞大部分受損，心肌纖維斷裂、壞死，有較多淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)；還可見廣泛出血及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維細(xì)胞增生，血管擴(kuò)張、淤血。而重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染組的心肌結(jié)構(gòu)完整，心肌纖維中未見淋巴細(xì)胞及單

18、核細(xì)胞浸潤(rùn)，亦未見出血及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。3討論轉(zhuǎn)基因是否成功，可以通過對(duì)基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)來確定。首先，用PCR在基因水平上證實(shí)外源目的基因是否已整合到靶細(xì)胞的染色體DNA上。結(jié)果顯示重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染的BALBc小鼠造血細(xì)胞的DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為274bp，說明其整合了H-2Kb cDNA基因。其次，用RT-PCR在RNA水平上證實(shí)目的基因是否在靶細(xì)胞內(nèi)有效地轉(zhuǎn)錄。結(jié)果顯示重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染后的BALBc小鼠造血細(xì)胞的RNA RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為409bp，是從H-2Kb mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA片段。說明其整合了H-2Kb cDNA基因，且能轉(zhuǎn)錄為mRNA。

19、最后，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)靶細(xì)胞膜上外源基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。結(jié)果顯示，逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后表達(dá)H-2Kb抗原的BALBc小鼠造血細(xì)胞占43.2，說明轉(zhuǎn)染后的造血細(xì)胞中有H-2Kb抗原的表達(dá)。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)觀察，用8.0Gy 60Co 射線照射受鼠對(duì)其整體情況無影響。若不回輸造血細(xì)胞，受鼠一般在照射2周后自行重建造血功能。照射后4h內(nèi)由尾靜脈輸入轉(zhuǎn)導(dǎo)H-2Kb基因或空載體的BALBc小鼠骨髓細(xì)胞懸液，目的主要是抑制受鼠自身的骨髓造血細(xì)胞，從而觀察導(dǎo)入的外源H-2Kb基因在受鼠體內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果表明：在輸注細(xì)胞2、8、12周后，均從受體BALBc小鼠的骨髓細(xì)胞中檢測(cè)到外源H-2Kb基因的存

20、在。提示：H-2Kb基因已穩(wěn)定地整合進(jìn)造血細(xì)胞的基因組內(nèi)，并可以在受體內(nèi)表達(dá)較長(zhǎng)時(shí)間。1963年，F(xiàn)ULMER等首先報(bào)道小鼠同系新生及胚胎心臟耳后移植模型。經(jīng)過不斷改進(jìn)，目前已建立了穩(wěn)定的小鼠耳后同種心臟心肌組織移植模型。該模型用心電作為指標(biāo)來精確監(jiān)測(cè)移植心肌的功能及排斥終點(diǎn)，指標(biāo)較為客觀，且手術(shù)簡(jiǎn)便，成功率高，重復(fù)性好，國(guó)內(nèi)外已用于移植免疫學(xué)的研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染組的移植心肌存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，與其它組比較，有顯著性差異（P0.05）。提示表達(dá)供體H-2Kb基因的造血細(xì)胞嵌合體回輸受體小鼠后，在隨后進(jìn)行的器官移植中，可以誘導(dǎo)受體對(duì)供體產(chǎn)生一定程度的特異性免疫耐受，使來自

21、原供體的移植物存活時(shí)間延長(zhǎng)。這種耐受對(duì)其特定的供體具有特異的耐受性，但對(duì)第三供體的抗原仍保留其完整的免疫反應(yīng)。因此可以克服由于應(yīng)用免疫抑制劑使免疫功能整體下降的缺點(diǎn)。利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)誘導(dǎo)器官移植免疫耐受的優(yōu)點(diǎn)是，基因修飾后的受體靶細(xì)胞帶有受體自身的全部MHC抗原，因而在受者體內(nèi)可以抵抗受體自身NK細(xì)胞的攻擊而存活較長(zhǎng)時(shí)間6，以達(dá)到誘導(dǎo)受體產(chǎn)生較長(zhǎng)期免疫耐受的目的。要使基因修飾后的受體靶細(xì)胞長(zhǎng)期存活，對(duì)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的選擇就應(yīng)盡量模擬正常的生理狀態(tài)。所以我們選擇受體小鼠骨髓造血細(xì)胞作為轉(zhuǎn)移H-2Kb基因的靶細(xì)胞79，并使之成功地表達(dá)了外源MHC-類抗原。然后將這種表達(dá)供體MHC-類抗原的受體造血細(xì)胞

22、回輸受體，以小鼠心肌移植為模型，進(jìn)行了誘導(dǎo)免疫耐受的研究。本研究為臨床移植控制免疫排斥反應(yīng)提供了一種新的方法和理論依據(jù)。基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（39470665）作者簡(jiǎn)介：李蓁（1969-），女，助理研究員，博士，主要從事移植免疫方面的研究。作者單位：李蓁（中山醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510080)徐鴻緒（中山醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510080)曾文濤（中山醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510080)陳規(guī)劃（中山醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510080)李樹濃(中山醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣東廣州510089)朱振宇(中山醫(yī)

23、科大學(xué)生物化學(xué)教研室，廣東 廣州510089）參考文獻(xiàn)：1SMITH CV，ROSENGARD BR，GUZZETE PC，et al.Approaches to transplantation toleranceJ.Transplant Proc，1991，23：21572161.2SAMBROOK J，F(xiàn)RITSCHN MF，MANIATIS T.Molecular cloning，a laboratorymanualM.2nd Ed.USA Cold Srping Harbor Laboratory Press，19891993.3KARGER BD，F(xiàn)ELGNER PL，GADEKTR

24、，et al.Evaluationofprocedures for transfection using lipofectin regeagentJ.Focus，1990，12：2529.4LU L，GE Y，LI ZH，et al.CD34 stemprogentior cells purified from cryopreserved normal cord blood can be transduced with highefficiency by a retroviral vector and expranded ex vivo with stable integration and expression of Fanconi anemia complementation C geneJ.Cell Transplant，1995，4：493498.5BABANG G，MORRIS RE，BABANG I，et al.Eva-luati