S100A4, A10在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及意義

1、S100A4, A10在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及意義                作者：柏干蘋，周麗娜，賀偉峰，羅高興，陳烯偉，陳光興，胡曉紅，石東文，方勇飛，吳軍【摘要】  目的：探討正常人與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者滑膜成纖維細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)差異，分析差異蛋白在RA發(fā)病中的作用. 方法：應(yīng)用固相pH梯度(IPG)雙向凝膠電泳(2?DE)分離正常人及RA患者滑膜成纖維細(xì)胞總蛋白質(zhì)；應(yīng)用雙向電泳凝膠分析軟件（PDQuest

2、7.3.1）對(duì)2?DE凝膠進(jìn)行量化比較分析；應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定部分差異蛋白質(zhì)，并用Western Blot、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)驗(yàn)證表達(dá)差異蛋白質(zhì). 結(jié)果：正常人及RA患者滑膜成纖維細(xì)胞蛋白2?DE凝膠圖譜上分別平均顯示896和992個(gè)點(diǎn). 有64個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)存在2倍以上的差異. 選取9個(gè)在RA滑膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，成功鑒定出鈣結(jié)合蛋白S100A4和S100A10兩個(gè)蛋白質(zhì). 經(jīng)Western Blot、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)驗(yàn)證這兩個(gè)蛋白在RA滑膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，與上述結(jié)果一致，并且發(fā)現(xiàn)S100A4在RA滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)分布發(fā)生了變化. 結(jié)

3、論：結(jié)合蛋白S100A4和S100A10可能參與RA的發(fā)病. S100A4在細(xì)胞中的表達(dá)易位可能與RA滑膜成纖維細(xì)胞表型改變有關(guān). 【關(guān)鍵詞】  滑膜成纖維細(xì)胞；蛋白質(zhì)組；雙向電泳；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；S100A4基因；S100A10基因【Abstract】 AIM: To find the differentially expressed proteins of synovial fibroblasts (SFs) from rheumatoid arthritis (RA) patients and normal controls using two?dimensional gel e

4、lectrophoresis (2?DE) and bioinformatics for providing useful and new clues to elucidate the pathogenesis and study the treatment of RA. METHODS: The total protein of SFs from either RA patients or normal ones was prepared by means of immobilized pH gradient based on 2?DE. Gels were scanned, and the

5、 images were processed with PDQuest 7.3.1 software. The differentiallly expressed proteins were identified by matrix?assisted laser desorption ionization?time?of?flight mass spectrometry (MALDI?TOF?MS). Then some of them were validated by Western Blot and immunocytochemistry. RESULTS: 896 protein sp

6、ots were detected in SFs of normal individuals, and 992 spots in RA, respectively. There were 64 different protein spots. A total of 9 protein spots that expressed at higher levels in SFs from RA were identified by MALDI?TOF?MS, and 2 valid proteins were obtained. They were calcium binding protein S

7、100A4 and S100A10. Western Blot and immunocytochemistry were used to further verify differentially expressed proteins. The results showed that expression levels  of S100A4 and S100A10 were significantly higher in SFs from RA than in SFs from normal individuals. Furthermore, the distribution of

8、S100A4  in SFs was changed. CONCLUSION: S100A4 and S100A10 might be involved in inflammation of synovitis in RA. These data will be used to elucidate the pathogenesis of RA for further study.【Keywords】 synovial fibroblasts; proteome; two?dimensional electrophoresis; rheumatoid arthritis; S100A4

9、; S100A100  引言    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種自身免疫性疾病，以非化膿性增生性滑膜炎為特點(diǎn)，逐漸導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞及關(guān)節(jié)功能的障礙. 近年來(lái)研究顯示滑膜成纖維細(xì)胞在RA的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著T細(xì)胞依賴途徑所不可解釋的重要作用，從而引起了人們的重視1-2. 雖然滑膜成纖維細(xì)胞在關(guān)節(jié)炎中的作用已得到肯定，但其功能的分子機(jī)制仍不明確. 本研究利用高分辨雙向電泳(two?dimensional gel electrophoresis, 2?DE)對(duì)正常人及RA患者滑膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，篩選差異蛋白

10、質(zhì)，為探討滑膜成纖維細(xì)胞在RA發(fā)病中的作用提供新的線索.1  材料和方法1.1  材料  人關(guān)節(jié)滑膜組織取自5例在重慶西南醫(yī)院及新橋醫(yī)院關(guān)節(jié)外科行關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA患者及7例正常人外傷后行滑膜切除術(shù)者，12例患者均簽署知情同意書(shū)，RA患者臨床診斷均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)3. 固相pH梯度(immobilized pH gradient gel strip, IPG）干膠條(pH 310, 17 cm)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺，3?玻?(3?駁ò孵?基)二甲基氨基?1?脖?基磺酸酯（3?玻?(3?cholamidopropyl)dimethylammoni

11、o?1?propanesulfonate, CHAPS），尿素，碘乙酰胺，二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)，十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)，兩性電解質(zhì)(pharmalyte, ph3-10),蛋白定量試劑盒，低熔點(diǎn)瓊脂糖(美國(guó)Bio?Rad公司)；硫脲（美國(guó)Sigma公司）；雙向電泳系統(tǒng)（Protein IEF Cell等電聚焦儀, Protein II Xi Cell垂直電泳槽, 校準(zhǔn)型光密度儀GS800 Calibrated Densitometer，凝膠定量軟件Quantity One 4.5.0，雙向電泳凝膠分析軟件PDQu

12、est7.3.1）（美國(guó)Bio?Rad公司）. S100A4及S100A10抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司），熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Chemidoc XRS（美國(guó)Bio?Rad公司）；免疫組化染色試劑盒(SP Kit)（北京中衫生物技術(shù)公司）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.1.2  方法1.2.1  滑膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)  參照文獻(xiàn)4的方法進(jìn)行滑膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng). 術(shù)中取出滑膜組織，立即于無(wú)菌條件下剪碎，2.5 g/L胰蛋白酶37消化2 h后，離心收集細(xì)胞，加入含有200 mL/L胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，置于37 50 mL/L CO2孵箱中令其貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞

13、生長(zhǎng)至85%滿時(shí)，胰蛋白酶消化進(jìn)行12傳代. 本實(shí)驗(yàn)中采用35代滑膜成纖維細(xì)胞.1.2.2  細(xì)胞總蛋白質(zhì)的制備5  取35代培養(yǎng)滑膜細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合期時(shí)，吸出培養(yǎng)液，用胰酶消化，PBS液洗滌細(xì)胞3次后，加入細(xì)胞裂解液（尿素7 mol/L，硫脲2 mol/L，CHAPS 40 g/L，DTT 65 mmol/L，pharmalyte 2 g/L）充分混勻，14 000 g，4離心1 h，取上清，用Bradford方法測(cè)定蛋白含量，并分裝于-80凍存?zhèn)溆?1.2.3  雙向電泳  采用pH 310 NL IPG膠條進(jìn)行2?DE分析. 按Bio?Rad

14、雙向電泳操作指南進(jìn)行. 400 g蛋白樣品加入水化樣品緩沖液(8 mol/L尿素，20 g/L CHAPS，pH 310的5 g/L IPG緩沖液，18 mmol/L DTT，0.02 g/L溴酚藍(lán))中溶脹后進(jìn)行等電聚焦. 程序設(shè)置如下:250 V、線性、30 min；1000 V、快速、1 h；10 000 V、線性、3 h；10 000 V、快速、40 000 Vh；500 V、快速、任意時(shí)間保持. 等電聚焦電泳后IPG膠條經(jīng)平衡轉(zhuǎn)移至1 mm厚的120 g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠上端進(jìn)行第二向SDS?PAGE電泳.1.2.4  銀染及凝膠圖像采集分析  SDS?PA

15、GE膠按照文獻(xiàn)6的方法進(jìn)行硝酸銀染色后，應(yīng)用校準(zhǔn)型光密度儀，凝膠定量軟件進(jìn)行掃描獲取圖像. 數(shù)字化圖像文件運(yùn)用雙向電泳凝膠分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，圖像分析過(guò)程包括蛋白點(diǎn)的檢測(cè)、量化、背景消減和點(diǎn)的匹配，進(jìn)行強(qiáng)度校正、點(diǎn)檢測(cè)、背景消減、匹配、1 D校正、建立平均凝膠分析等.1.2.5  質(zhì)譜鑒定  切割蛋白質(zhì)點(diǎn)置于微量離心管中，經(jīng)洗滌、脫色及進(jìn)行膠內(nèi)蛋白質(zhì)酶解后，將從蛋白質(zhì)差異點(diǎn)抽提所得的肽段通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Autoflex）進(jìn)行分析，獲取蛋白樣品的肽質(zhì)量指紋圖，最后應(yīng)用肽質(zhì)量和碎片離子檢索分析軟件（Mascot）在人類蛋白質(zhì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI、SW

16、ISS?PROT）中搜尋，獲得蛋白質(zhì)的相關(guān)信息.1.2.6  Western Blot驗(yàn)證差異蛋白  將20 g滑膜總蛋白加入2×SDS上樣緩沖液（0.1 mol/L Tris pH 6.8, 0.2 mmol/L DTT,40 g/L SDS,200 mL/L甘油，2 g/L溴酚藍(lán)），100變性5 min，上樣， 120 V 120 g/L SDS?PAGE電泳2 h，1 mA/cm2膠面積電轉(zhuǎn)30 min. 含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，分別加入抗S100A4，S100A10抗體，4 振蕩孵育膜過(guò)夜. TBST洗膜10 min×3次

17、. 加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫1 h. TBST洗膜10 min×3次. 凝膠成像分析儀化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，掃描、保存、分析圖像.1.2.7  免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)驗(yàn)證差異蛋白  制備正常及RA滑膜成纖維細(xì)胞爬片. 采用SP法檢測(cè)S100A10和?財(cái)交?肌肌動(dòng)蛋白(?SMA).  染色程序按SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每批染色均設(shè)立空白對(duì)照，以PBS液代替一抗. 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)S100A4. 用冷的甲醇固定，-20 10 min； -20用冷的丙酮滲透1 min. 水洗后，一抗孵育，37孵育45 min. PBS沖洗5 min×3次， PBS稀釋標(biāo)記二

18、抗1100，室溫孵育30 min. PBS沖洗5 min×3次，甘油緩沖液（9份優(yōu)質(zhì)甘油加1份pH 7.4 PBS液）封片，并對(duì)染色后的細(xì)胞片進(jìn)行顯微鏡下觀察、攝片. 每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，應(yīng)用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行處理，隨機(jī)選場(chǎng)，自動(dòng)采點(diǎn)分析，測(cè)得陽(yáng)性細(xì)胞積分吸光度值, 分析比較S100A4，S100A10，?SMA表達(dá)量的變化（積分吸光度值越高，表示陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)域越大或信號(hào)越強(qiáng)）.2  結(jié)果2.1  滑膜成纖維細(xì)胞蛋白質(zhì)組圖譜差異分析及差異蛋白鑒定  應(yīng)用雙向電泳,獲得了重復(fù)性較好的滑膜成纖維細(xì)胞的雙向電泳銀染圖譜

19、(圖1). 正常人及RA患者2?DE銀染圖譜上分別平均顯示896,992個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn). 有64個(gè)蛋白點(diǎn)在正常、RA滑膜成纖維細(xì)胞間有2倍以上的顯著性量變. 結(jié)合肉眼觀察選取了9個(gè)表達(dá)差異點(diǎn)進(jìn)行了MALDI?TOF?MS，成功鑒定2個(gè)在RA滑膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)鈣結(jié)合蛋白S100A4,S100A10. 成功鑒定的蛋白質(zhì)點(diǎn)在膠圖中位置及名稱如圖1B所示，其名稱及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相關(guān)信息見(jiàn)表1.A：正?；こ衫w維細(xì)胞;B：RA滑膜成纖維細(xì)胞.圖1  滑膜成纖維細(xì)胞2?DE圖譜（硝酸銀染色，pH 310 NL）（略）表1  正常人及RA患者滑膜成纖維細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)信息（略）2

20、.2  S100A4, S100A10在滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá) 2.2.1  S100A4在滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)  Western Blot結(jié)果顯示S100A4蛋白在RA滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高,該結(jié)果與蛋白質(zhì)組的檢測(cè)結(jié)果一致（圖2）. 光鏡觀察在正?；こ衫w維細(xì)胞S100A4表達(dá)在細(xì)胞漿，但在RA滑膜成纖維細(xì)胞中其分布改變，在細(xì)胞漿和細(xì)胞核均可見(jiàn)熒光分布，且細(xì)胞核較強(qiáng). RA滑膜成纖維細(xì)胞中的熒光明顯強(qiáng)于正?；こ衫w維細(xì)胞，圖像分析系統(tǒng)顯示S100A4在RA滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正?；こ衫w維細(xì)胞(圖3).2.2.2  S100A10在

21、滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)  Western Blot結(jié)果顯示S100A10蛋白在RA滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高（圖2）. 光鏡觀察S100A10均分布在正常、RA滑膜成纖維細(xì)胞的細(xì)胞漿，細(xì)胞漿染成棕黃色，RA滑膜成纖維細(xì)胞中的染色明顯深于正?；こ衫w維細(xì)胞，圖像分析系統(tǒng)顯示S100A10在RA滑膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)明顯高于正?；こ衫w維細(xì)胞(圖4).A：正常滑膜成纖維細(xì)胞;B：RA滑膜成纖維細(xì)胞.圖2  S100A4和S100A10在正常和RA滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)（略）A：正?；こ衫w維細(xì)胞; B: RA滑膜成纖維細(xì)胞.圖3  S100A4在滑膜成纖維細(xì)胞中的表

22、達(dá)  SP ×200（略）2.3  ?SMA在滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)  光鏡觀察正?；こ衫w維細(xì)胞中無(wú)?SMA表達(dá)，RA滑膜成纖維細(xì)胞中約20的細(xì)胞表達(dá)?SMA，細(xì)胞漿染成棕黃色，且細(xì)胞由典型的長(zhǎng)梭形變?yōu)楸馄?、不?guī)則形，胞漿內(nèi)充滿纖細(xì)的與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行排列的肌微絲(圖5).A：正?；こ衫w維細(xì)胞; B: RA滑膜成纖維細(xì)胞.圖4  S100A10在滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)  ×200（略）圖5  ?SMA在RA滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)  ×200（略）3  討論  

23、60; RA滑膜成纖維細(xì)胞在細(xì)胞周期中增生異?；钴S，呈腫瘤樣增生，是造成軟骨破壞的一個(gè)重要原因. 因此，闡明滑膜增生機(jī)制對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重要的臨床意義.    S100A4, S100A10是鈣結(jié)合蛋白S100家族成員,在RA的滑膜中已證實(shí)有S100蛋白的表達(dá)7，如S100A4，S100A8/9，S100A12以及本研究發(fā)現(xiàn)的S100A10. S100A4在腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移中的作用已毋庸置疑. 也有證據(jù)表明S100A4可能參與SF的進(jìn)展性、侵襲性、腫瘤樣的生長(zhǎng)8-9，但未見(jiàn)其確切機(jī)制的報(bào)道. p53是S100A4的靶蛋白之一，野生型p53主要誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)分

24、化，抑制腫瘤. RA滑膜成纖維細(xì)胞上可檢測(cè)到大量的p53表達(dá)10，并且主要位于患者病變的滑膜成纖維樣細(xì)胞上，但其中約40%的 p53 cDNA克隆發(fā)生突變，因而不能對(duì)異常增生的滑膜成纖維細(xì)胞發(fā)揮有效的作用. 因此S100A4可能通過(guò)與p53相互作用的途徑調(diào)節(jié)著滑膜細(xì)胞的異常增殖，參與SF的侵襲性生長(zhǎng). 另一方面，我們發(fā)現(xiàn)S100A4在細(xì)胞中的分布發(fā)生了變化. 其發(fā)生表達(dá)易位的原因還不清楚，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道11，在培養(yǎng)基中加入TGF，可使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞. 在這些分化的肌成纖維細(xì)胞中，S100A4主要表達(dá)在細(xì)胞核，本研究也發(fā)現(xiàn)約20的滑膜成纖維細(xì)胞表達(dá)?SMA，因此推測(cè)S100A4在RA

25、滑膜細(xì)胞的表達(dá)分布變化可能與滑膜成纖維細(xì)胞的表型改變有關(guān). S100A4在滑膜成纖維細(xì)胞的增殖及表型改變中的作用還需進(jìn)一步的功能研究.    膜聯(lián)蛋白（Annexin II）、磷脂酶A2（PLA2）、纖溶酶原均為S100A10的相互作用蛋白，因此S100A10不僅可調(diào)節(jié)PLA2的活性具抗炎作用，且可與纖溶酶原結(jié)合，調(diào)節(jié)纖溶酶活化作用. 體內(nèi)、外研究均發(fā)現(xiàn)12-13，纖溶酶原激活因子（PA）在正常人以及RA、骨關(guān)節(jié)炎（OA）等炎癥性關(guān)節(jié)病的軟骨、滑膜、滑液及血漿中均有表達(dá)，且RA患者的滑膜組織中尿激酶型PA（uPA）抗原濃度均明顯高于正常人及OA滑膜組織，而組織型P

26、A（tPA）抗原水平在不同患者則呈不同表現(xiàn). 故S100A10, uPA在RA中的表達(dá)明顯高于正常人和其他炎癥性關(guān)節(jié)疾病可能與RA的滑膜增殖在很多方面類似于局限侵襲性生長(zhǎng)的腫瘤有關(guān).【參考文獻(xiàn)】  1 Morand EF, Leech M. Macrophage migration inhibitory factor in rheumatoid arthritisJ. Front Biosci, 2005,10:12-22.2 DeBusk LM, Chen Y, Nishishita T, et al. Tie2 receptor tyrosine kinase, a major

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