FK-506抑制大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng)的研究

1、    FK-506抑制大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng)的研究        【摘要】目的建立近交系大鼠穿透性角膜移植動(dòng)物模型，觀察結(jié)膜下注射FK-506對(duì)角膜移植免疫排斥反應(yīng)的抑制作用。方法將近交系Lou大鼠28只作受體，14只F344大鼠作供體，分為3組，術(shù)后結(jié)膜下分別按每公斤體重注射0.1 mg FK-506、3 mg CsA及生理鹽水，共2周。對(duì)角膜植片進(jìn)行臨床觀察，以混濁、水腫和新生血管3項(xiàng)指標(biāo)作為臨床評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果3組角膜植片的存活時(shí)間分別為(22.1±5.17

2、)、(18.4±1.4)及(12.1±2.13)天，三者間差異有顯著性(P<0.01)。結(jié)論FK-506能顯著延長(zhǎng)大鼠角膜植片的存活時(shí)間，是一種有效的新型免疫抑制劑?！娟P(guān)鍵詞】大鼠角膜移植，穿透性移植物抗宿主反應(yīng)FK-506Experimental studies on the effect of the immunosuppressant FK-506on penetrating keratoplasty rejection model in ratsL Lan*, ZHANG Wenhua, SUN Xuguang.*Department of Ophthalmo

3、logy, Affiliated Tong Ren Hospital,Capital Medical University, Beijing 100730【Abstract】ObjectiveTo study the immunosuppressive effects of FK-506 on allogeneic transplantation in a rat model. MethodsInbred strain Lou rats were used as recipients, and F344 rats were used as donors. Subconjunctival inj

4、ection of FK-506 0.1 mg/kg and cyclosporine A (CsA) 3 mg/kg were administered respectively for 2 weeks, and the grafts were inspected by clinical evaluation. ResultsThe group receiving FK-506 had a significant delay in allograft rejection with mean survival time (22.1±5.17) days vs. (18.4±

5、1.4) days for the CsA group and (12.1±2.13) days for the control group (P<0.01). ConclusionIt is indicated that FK-506 would be a useful drug to suppress corneal graft rejection.【Key words】RatsKeratoplasty, penetratingGraft vs host reactionFK-506免疫排斥反應(yīng)是導(dǎo)致角膜移植手術(shù)失敗的首要原因1，應(yīng)用免疫抑制劑是其主要的治療方法，皮質(zhì)類固醇

6、是較常用的藥物2，但其治療效果卻不盡如人意，對(duì)于高?；颊?，激素治療常常無效。近年來應(yīng)用環(huán)胞霉素A(cyclosporine A，CsA)使角膜移植的預(yù)后有所改觀，但排斥反應(yīng)仍有發(fā)生3。因此，新型高效免疫抑制劑的研究具有重要意義。FK-506是一種新型免疫抑制劑，其免疫抑制作用強(qiáng)于CsA4，5。我們應(yīng)用大鼠建立穿透性角膜移植(penetrating keratoplasty,PKP)動(dòng)物模型，研究FK-506對(duì)角膜移植免疫排斥反應(yīng)的抑制作用。材料和方法一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用近交系大鼠(Lou，RT1U)28只作受體，與其主要組織相容性系統(tǒng)完全不同的另一近交系大鼠(F344，RT1V)14只作供體。供、

7、受體均為雌性，體重150200 g，年齡23個(gè)月。受體動(dòng)物右眼接受角膜移植，供體雙眼取材后處死。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所。二、手術(shù)方法參照Williams等6方法，術(shù)前15分鐘以1%阿托品滴眼液和美多麗-P(0.5%托品酰胺，0.5%鹽酸新福林)散瞳，腹腔內(nèi)注射2.5%硫賁妥鈉1015 mg/kg麻醉。手術(shù)在顯微鏡下進(jìn)行。首先于供體角膜鉆取直徑3.5 mm植片，于受體右眼行PKP，用直徑3.0 mm環(huán)鉆鉆除中央?yún)^(qū)角膜,將植片置于植床，以10-0尼龍線間斷縫合8針，線結(jié)不埋藏。術(shù)畢散瞳，結(jié)膜下注射慶大霉素2 000 U，瞼緣縫合。三、藥品FK-506結(jié)晶系日本Fujisawa醫(yī)藥公司

8、惠贈(zèng)，使用前溶入生理鹽水中制成混懸液。CsA系瑞士Sandoz藥廠產(chǎn)品，使用前用生理鹽水稀釋。四、治療方案FK-506組10只大鼠，自手術(shù)當(dāng)天開始連續(xù)右眼結(jié)膜下注射0.1 mg/kg FK-506，共2周；CsA組8只大鼠作為陽性對(duì)照，結(jié)膜下注射3 mg/kg CsA，用法同前；陰性對(duì)照組10只大鼠，結(jié)膜下注射生理鹽水。所有動(dòng)物術(shù)后均連續(xù)結(jié)膜下注射慶大霉素2天，0.25%氯霉素及美多麗-P滴眼，每天1次，共1周。五、臨床觀察自術(shù)后第1天開始，Lou大鼠每天經(jīng)乙醚麻醉后在裂隙燈下觀察直至排斥反應(yīng)發(fā)生。以后每周觀察2或3次，連續(xù)觀察24周。同時(shí)觀察其角膜植片，并對(duì)角膜混濁、水腫及新生血管3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)

9、行評(píng)分，評(píng)分參照Holland等7方法，3項(xiàng)評(píng)分之和為當(dāng)日排斥反應(yīng)指數(shù)(rejectionindex，RI)，當(dāng)RI6時(shí)，視為排斥反應(yīng)發(fā)生。術(shù)后有嚴(yán)重前房出血、虹膜廣泛前粘連、傷口裂開及植片感染的大鼠均在本研究之外。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本文數(shù)據(jù)采用計(jì)算機(jī)Systat統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，對(duì)方差不齊者先用以10為底的對(duì)數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換后再行方差分析。結(jié)果一、植片存活時(shí)間FK-506、CsA和對(duì)照組大鼠角膜植片存活時(shí)間分別為(22.1±5.17)、(18.4±1.41)和(12.1±2.13)天。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，F(xiàn)K-506和CsA均能明顯延長(zhǎng)角膜植片的存活時(shí)間，與對(duì)照組

10、相比差異有顯著性(P<0.01)，且FK-506的作用優(yōu)于CsA(P<0.01)。二、植片各參數(shù)的改變3組大鼠角膜植片在用藥期間RI、混濁、水腫及新生血管指數(shù)的改變見表1。結(jié)果表明，對(duì)照組RI、混濁、水腫3項(xiàng)指標(biāo)均明顯高于FK-506和CsA組(P<0.05)，但FK-506、CsA 2組間差異無顯著性；3組間新生血管指數(shù)差異無顯著性(P>0.05)。表1各組大鼠角膜植片在術(shù)后用藥期間植片情況的比較組別鼠數(shù)RI(±s)混濁(±s)水腫(±s)新生血管(±s)FK-506102.043±1.2650.479±0.

11、2670.629±0.191.057±0.849CsA82.43±1.2990.646±0.3320.680±0.2081.081±0.847對(duì)照103.579±1.911.057±0.6251.421±0.4441.171±0.902P值<0.05<0.05<0.05>0.053組大鼠角膜植片的RI及其中每項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分的動(dòng)態(tài)改變見14。對(duì)照組所有指標(biāo)評(píng)分均呈持續(xù)上升，而兩用藥組的RI、混濁及水腫3項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分在用藥期間均明顯低于對(duì)照組，且FK-506組低于CsA組，二者間差

12、異無顯著性。停藥后各項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分逐漸上升，3組動(dòng)物植片新生血管的發(fā)生發(fā)展趨勢(shì)基本一致。新生血管一般于術(shù)后46天出現(xiàn)，約1012天達(dá)角膜傷口，并很快進(jìn)入植片周邊，有些大鼠的新生血管最終可達(dá)角膜中央，而另一部分大鼠的新生血管則表現(xiàn)出退行性變的趨勢(shì)。1術(shù)后鼠角膜植片排斥指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化2術(shù)后鼠角膜植片混濁指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化3術(shù)后鼠角膜植片水腫指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化4術(shù)后鼠角膜植片新生血管指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化討論一、大鼠是角膜移植免疫學(xué)研究的理想動(dòng)物模型角膜移植免疫學(xué)研究中，大鼠已逐漸取代傳統(tǒng)的兔模型。因?yàn)橥玫拿庖呦到y(tǒng)背景不清，供、受體間的組織相容性程度不能控制，同時(shí)也缺乏免疫學(xué)研究中必需的抗兔細(xì)胞的單克隆抗體；而近交系大

13、鼠的免疫學(xué)背景、組織相容性系統(tǒng)明確，供、受體間的組織相容性程度可根據(jù)需要進(jìn)行選擇，抗大鼠細(xì)胞及免疫分子的單克隆抗體豐富，且角膜組織上的主要組織相容性抗原的表達(dá)與人類角膜一致8，是角膜移植免疫學(xué)研究的理想動(dòng)物模型。本研究在供、受體間主要組織相容性抗原完全不同8的大鼠中建立PKP動(dòng)物模型，對(duì)照組術(shù)后平均12天100%發(fā)生排斥反應(yīng)，表明此動(dòng)物模型利于角膜移植的免疫學(xué)研究和免疫抑制劑治療的研究。二、FK-506可抑制角膜移植免疫排斥反應(yīng)FK-506是從Tsukubaensis鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中提取的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有顯著的免疫抑制功能，可抑制機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫過程，在抑制多種器官同種異體移植術(shù)后排

14、斥反應(yīng)方面，也顯示了高度的免疫抑制作用，并明顯強(qiáng)于CsA4，5。本研究中FK-506的用量為CsA的1/30，但其作用卻較CsA強(qiáng)。FK-506與CsA的免疫抑制機(jī)制相似，主要是通過與T細(xì)胞表面相應(yīng)的結(jié)合蛋白（FK-506結(jié)合蛋白和環(huán)親合素）結(jié)合，作用于細(xì)胞內(nèi)的鈣和鈣調(diào)蛋白依賴性的蛋白磷酯酶，使T細(xì)胞活化核因子的核內(nèi)轉(zhuǎn)移受到抑制，從而抑制轉(zhuǎn)錄IL-2、IL-2R的基因表達(dá)，使T細(xì)胞的增殖和免疫活性受到抑制4。IL-2是由活性T細(xì)胞合成分泌、具有T細(xì)胞生長(zhǎng)因子特點(diǎn)的細(xì)胞因子，活性T細(xì)胞分泌IL-2，同時(shí)表達(dá)IL-2R，IL-2與IL-2R的結(jié)合進(jìn)一步促進(jìn)了T細(xì)胞的增殖分化，所以IL-2和IL-2

15、R是移植排斥免疫抑制療法的重要靶分子4。我們應(yīng)用大鼠模型研究FK-506對(duì)角膜移植排斥反應(yīng)的抑制作用。FK-506和CsA組在用藥期間均無排斥反應(yīng)發(fā)生，植片的混濁和水腫程度明顯低于對(duì)照組，術(shù)后第2周末的植片存活率均為100%。但停藥后兩組角膜植片的混濁、水腫逐漸加重，并分別于停藥后421天（平均存活22.1天）和26天（平均存活18.4天）發(fā)生排斥反應(yīng)。而術(shù)后對(duì)照組角膜植片的各項(xiàng)評(píng)分均持續(xù)上升，角膜植片的混濁、水腫逐漸加重，術(shù)后第2周末的植片存活率僅為10%。作者在動(dòng)物模型臨床觀察的基礎(chǔ)上，應(yīng)用免疫組化的方法,對(duì)角膜移植排斥反應(yīng)進(jìn)行免疫病理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)FK-506可抑制PKP術(shù)后多種免疫細(xì)胞的

16、浸潤(rùn)和免疫分子的表達(dá)9。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)K-506可明顯延長(zhǎng)大鼠角膜植片的存活時(shí)間，且作用優(yōu)于CsA。但FK-506并不能使機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受，停藥后排斥反應(yīng)仍可發(fā)生。此外,無論是FK-506或CsA，均不能抑制新生血管的發(fā)生和發(fā)展，這可能與新生血管的生成因子有關(guān)，對(duì)于這些因子的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相似10，11,Nishi等10采用F344大鼠對(duì)Lewis大鼠PKP模型,術(shù)后腹腔內(nèi)分別注射0.3、1.0及3.0 mg/kg FK-506，共2周,對(duì)照組動(dòng)物植片于3周內(nèi)全部排斥,而FK-506組角膜植片則可存活48周。作者單位：呂嵐（100730 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北

17、京同仁醫(yī)院眼科）；張文華孫旭光（北京市眼科研究所）參考文獻(xiàn)1Williams KA, Muehlberg SM, Lewis RF, et al. How successful is corneal transplantation? a report from the Australian corneal graft register. Eye,1995,9:219-227.2Rinne JR, Stulting RD. Current practices in the prevention and treatment of corneal graft rejection.Cornea,199

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