人參皂苷Rb3對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷的保護(hù)作用(一)

1、人參皂苷Rb3對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷的保護(hù)作用(一)作者：胡瑜，陳浩凡，臧林泉，巫瑋【摘要】 目的 探討3種人參皂苷Rb3對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷的保護(hù)作用。 方法 將48只大鼠隨機(jī)分成6組：假手術(shù)組、模型組、人參皂苷Rb3 20、40、80mg/kg組和陽(yáng)性對(duì)照藥血栓通注射液(XST)組；采用插線法使大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）建立大鼠局灶性腦缺血模型，于造模24 h后進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，測(cè)定腦組織含水量以及腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量，計(jì)算腦梗死面積百分比，并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果 人參皂苷Rb3 40、80 mg/kg能明顯緩解腦缺血大鼠的行為學(xué)癥狀，減輕其腦水腫程度

2、，降低血清中MDA含量，升高SOD含量，并能減少其腦梗死面積，減輕組織病理學(xué)損傷。結(jié)論 人參皂苷Rb3對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷有較明顯的保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】 腦缺血； 大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）；人參皂苷Rb3Protective effects of ginsenoside Rb3 on focal cerebral ischemic injury in ratsAbstract:Objective To study the protective effects of ginsengoside Rb3 on focal cerebral ischemia in rats.Methods 48

3、 SD rats were divided randomly into shamoperated group, model group, ginsenoside Rb3 (20, 40 and 80 mg/kg) group and positive control drug (XST) group. The model of focal cerebral ischemia was made by middle cerebral artery occlusion (MCAO) with nylon suture; neuroethological scores were gotten 24 h

4、 after the development of the model. The water content of brain tissue, the activities of SOD and MDA in brain tissue and were measured, the percentage of cerebral infarction area to total brain area was calculated, and histopathological examination was conducted. Results Ginsenoside Rb3 (at 40 mg/k

5、g and 80 mg/kg) could significantly reduce the scores for neurological deficits and brain edema, improve the activities of SOD, lower the content of MDA, reduce the cerebral infraction area, and alleviate the cerebral ischemia injury. Conclusion Ginsenoside Rb3 had obvious protective effects on the

6、focal cerebral ischemia in rats.Key words:brain ischemia;middle cerebral artery occlusion (MCAO);ginsenoside Rb3腦卒中是造成人類致死和致殘三大原因之一，腦對(duì)缺血缺氧極為敏感，腦缺血會(huì)引起腦組織不同程度的損傷，嚴(yán)重者影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能。目前對(duì)缺血性腦卒中神經(jīng)元損傷的機(jī)理進(jìn)行了深入的研究1，認(rèn)為自由基的生成增加、中性粒細(xì)胞及巨嗜細(xì)胞的聚集、蛋白溶解酶的釋放以及再灌注后血腦屏障的雙相性開放是腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制。另外血腦屏障完整性在腦缺血后再灌注中發(fā)揮重要的病理生理作用：腦缺血再

7、灌注后可使腦梗死及血腦屏障的破壞加重，且血腦屏障的破壞與腦血流的恢復(fù)存在相關(guān)性，局灶性腦缺血早期再灌注雖然有助于保護(hù)半暗區(qū)組織，但遲發(fā)性再灌注可加重腦損傷。腦梗死早期予以溶栓恢復(fù)缺血區(qū)腦血流可以減輕缺血性損傷，然而延遲再通可增加出血轉(zhuǎn)化及腦水腫的危險(xiǎn)2，這限制了溶栓治療的應(yīng)用與推廣。因此開發(fā)防治腦組織缺血性損傷的藥物，延長(zhǎng)血流再通的有效時(shí)間窗是有待解決的問(wèn)題，也一直是相關(guān)學(xué)科研究的重點(diǎn)之一。人參皂苷是人參中的主要活性成分，到目前為止已確定了結(jié)構(gòu)的皂苷單體至少在40 種以上。有關(guān)人參皂苷抗腦缺血損傷作用的報(bào)道雖然已有不少，但一般都是用人參總皂苷或人參二醇組皂苷，二者均是多種單體的混合成分，其作用

8、的強(qiáng)弱和其所含單體的不同有關(guān)3。因此，對(duì)人參皂苷單體的研究顯得極為重要。本實(shí)驗(yàn)著重研究了人參皂苷單體Rb3抗腦缺血損傷作用。1 材料與方法1.1 藥品及試劑注射用人參皂苷Rb3 單體（50 mg/mL，由中山大學(xué)藥學(xué)院提供）,血栓通注射液(由廣東永康藥業(yè)有限公司提供，生產(chǎn)批號(hào)：0709011),氯代三苯基四氮唑（紅四氮唑或TTC）(Fluka公司產(chǎn)品),SOD和MDA檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程公司產(chǎn)品)。1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法雄性清潔級(jí)SD大鼠（購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào)：2006A064），體質(zhì)量230280 g，隨機(jī)分成：假手術(shù)組、模型對(duì)照組、人參皂苷Rb3低劑量組、人

9、參皂苷Rb3中劑量組、人參皂苷Rb3高劑量組和血栓通注射液組，每組8只。于術(shù)前5 d每天1次分別給各組腹腔注射：人參皂苷Rb3低劑量20 mg/kg, 人參皂苷Rb3中劑量40 mg/kg, 人參皂苷Rb3高劑量80 mg/kg, 血栓通注射液0.45 mL/kg, 造模前0.5 h靜脈注射給藥1次；造模后4 h和10 h再分別進(jìn)行腹腔注射給藥。模型組和假手術(shù)組大鼠給予生理鹽水，給藥時(shí)間及體積同上。1.3 動(dòng)物模型制備取0.235 mm尼龍漁線，截作每段8 cm左右，頭端0. 5 mm加熱成光滑的球形,距插入端10 mm、18 mm、20 mm三處分別用標(biāo)記筆作標(biāo)記，75%()乙醇處理后置生理

10、鹽水中備用。1.3.2 手術(shù)方法將大鼠用10%()水合氯醛3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉，頸部正中切口,分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，并分離翼額動(dòng)脈（PPA）。在頸內(nèi)動(dòng)脈近端備線、遠(yuǎn)端放置動(dòng)脈夾，頸總動(dòng)脈近分叉處切口，插入拴線，插至稍感阻力時(shí)即可，其深度為1720 mm，動(dòng)脈外用手術(shù)線綁扎固定。栓線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，入顱至大腦前動(dòng)脈，阻斷大腦中動(dòng)脈所有血流來(lái)源。傷口和腹腔均注入少量抗生素后，縫合皮膚，回籠飼養(yǎng)。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后24 h，每只取手術(shù)側(cè)腦小片進(jìn)行TTC染色，變白色者為模型成功；動(dòng)物手術(shù)后有明顯手術(shù)側(cè)（即左側(cè)）Horner癥（左側(cè)眼瞼下垂，眼球

11、凹陷）及手術(shù)側(cè)（即左側(cè)）偏癱體征（不能完全伸展左前肢，行走時(shí)向左側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈）。1.4 行為學(xué)評(píng)分按照Longa 4 神經(jīng)功能缺損評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分,0 分: 無(wú)神經(jīng)損傷癥狀;1 分: 不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪;2 分: 向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3 分: 向?qū)?cè)傾倒;4 分: 不能自發(fā)行走, 意識(shí)喪失。神經(jīng)功能缺損評(píng)分時(shí)間點(diǎn)同上。1.5 腦含水量測(cè)定神經(jīng)病學(xué)評(píng)分后，快速斷頭取鼠大腦。取左側(cè)半腦后半部分分別稱濕重，置120 烤箱烘干至恒重，按以下公式計(jì)算腦組織含水量，腦組織含水量(%)（濕重干重）/濕重100。1.6 腦組織勻漿測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的含量腦組織勻漿液的制備:迅速斷頭取腦,取

12、左側(cè)半腦前小部分放于液氮中保存待測(cè)。從液氮中取出半腦稱取100 mg,后置于9倍的生理鹽水中,用研磨器于冰塊上研磨,制成100%(/)腦勻漿液, 3 500 r/min,離心10 min。檢測(cè)方法：MDA測(cè)定采用硫代巴比妥酸法, SOD活力檢測(cè)采用黃嘌呤氧化法。1.7 腦梗死范圍的測(cè)定造模后24 h大鼠，快速取全腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冰凍25 min。然后行冠狀切面取大腦中間一片，迅速置1紅四氮唑（TTC）中，避光，37 溫孵20 min，其間每隔78 min翻動(dòng)一次，染色后以4多聚甲醛固定。染色結(jié)果：正常組織呈紅色，損傷梗死組織呈白色。拍照后以稱重法計(jì)算腦梗死面積百分比。1.8 病理

13、檢查造模后24 h大鼠腦，于視交叉處行冠狀切面取左側(cè)腦中間一小片放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液保存超過(guò)48 。每個(gè)組織塊均以乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片厚約4 ，進(jìn)行蘇木素伊紅(HaematoxylinEosin，HE)染色。光鏡下觀察腦組織病理學(xué)變化。1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示, 運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行資料t檢驗(yàn)，P0.05為差異有顯著性。表1 對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響與假手術(shù)組比較：P0.01；與模型組比較：*P0.05，*P0.012 結(jié) 果2.1 行為學(xué)評(píng)分由表1可見，與模型組比較，人參皂苷Rb3 40、80 mg/kg組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低，有明顯

14、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。2.2 對(duì)腦缺血大鼠腦含水量的影響由表2可見，腦缺血24 h大鼠腦含水量明顯升高，與假手術(shù)組比較差異有顯著性（P0.01）。與模型組比較，人參皂苷Rb340、80 mg/kg組腦含水量明顯降低，差異有顯著性（P0.01）。2.3 腦組織中SOD和MDA含量表2 對(duì)腦缺血大鼠腦含水量的影響與假手術(shù)組比較：P0.05;與模型組比較：*P0.01表3 對(duì)腦缺血大鼠腦組織中SOD和MDA含量的影響與假手術(shù)組比較：P0.05;與模型組比較：*P0.05，*P0.01 由表3可見，與假手術(shù)組比較，模型組腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）含量明顯升高，丙二醛含量明顯降低，與模型組比較

15、差異有顯著性（P0.01）。人參皂苷Rb3 40、80 mg/kg組腦組織中MDA含量明顯低于模型組，差異有顯著性（P0.05）。人參皂苷Rb3各劑量組腦組織中SOD含量均高于模型組，差異有顯著性（P0.01）。2.4 對(duì)腦缺血大鼠腦梗死面積的影響表4 對(duì)腦缺血大鼠腦梗死面積的影響與假手術(shù)組比較：P0.05;與模型組比較：*P0.05由表4可見，人參皂苷Rb340、80 mg/kg組腦梗死面積均明顯小于模型組，差異有顯著性（P0.05）。2.5 腦組織形態(tài)學(xué)變化大鼠經(jīng)腦梗死術(shù)后24 h，病灶側(cè)腦表面蒼白、無(wú)光，腦表面血管較對(duì)側(cè)充血，顏色變暗。鏡下可見左半腦組織主要呈缺血性病理改變，經(jīng)藥物治療后

16、充血腦組織缺血程度減輕。假手術(shù)組無(wú)明顯缺血性病理改變。各實(shí)驗(yàn)組大腦組織病理學(xué)改變?nèi)缦拢杭偈中g(shù)組：神經(jīng)元的大小和形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，無(wú)明顯水腫；神經(jīng)細(xì)胞的胞漿豐富，核膜清楚，核仁清晰；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞核仁清晰，腦漿通亮或淡染，小血管、毛細(xì)血管周圍間隙極小。模型對(duì)照組：腦組織病變區(qū)域，間質(zhì)疏松，明顯水腫；水腫區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、小血管及毛細(xì)血管周圍間隙明顯變寬，多數(shù)細(xì)胞腫脹變形、著色加深；胞漿、胞核界線明顯不清，部分胞核固縮明顯，呈三角形，核膜結(jié)構(gòu)模糊，核仁不清或消失?？梢娪心X組織毛細(xì)血管充血，有少量紅細(xì)胞外漏至腦組織，可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。人參皂苷治療各組：比模型組病變有明顯改善，腦組織神經(jīng)細(xì)胞

17、、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、小血管及毛細(xì)血管周圍間隙略變寬，皮層細(xì)胞變性程度明顯減輕，部分細(xì)胞輕度或中度腫脹，胞核和胞漿有些不清，核仁比較模糊。以高、中劑量改善較明顯。血栓通組也有明顯的改善。3 討 論關(guān)于局灶腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ鸵延泻芏鄨?bào)道5， 目前一致認(rèn)為選用大鼠具有成本低、種系純合性好, 與人類有類似的腦血管解剖特點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn), 是最常選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。此外, 大鼠抗感染能力較強(qiáng), 生命力也強(qiáng), 實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物感染較少, 存活時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)體征評(píng)分與梗死體積的相關(guān)性研究, 國(guó)外早有報(bào)道。Bederson認(rèn)為神經(jīng)系統(tǒng)體征評(píng)分與梗死體積有明顯的相關(guān)性6,7。本研究結(jié)果也證實(shí)，神經(jīng)學(xué)評(píng)分越高出現(xiàn)梗死灶就越明顯

18、。本研究選用SD大鼠復(fù)制MCAO大鼠模型，觀察人參皂苷Rb3對(duì)缺血性腦中風(fēng)的防治作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組偏癱體征典型，腦水腫癥狀明顯，腦梗死面積廣泛，表明本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒊晒?。而人參皂苷Rb3中、高劑量可改善中動(dòng)脈栓塞所致局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能,明顯縮小梗死面積、減輕腦水腫，顯著降低中動(dòng)脈栓塞大鼠大腦組織中的MDA 含量,增加SOD 含量。病理切片也表明人參皂苷Rb3可明顯改善局灶性腦缺血時(shí)大鼠的腦代謝；維持腦缺血狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞的正常形態(tài)和功能,延緩、減輕其壞死，表明人參皂苷Rb3 對(duì)大鼠腦缺血有較明顯的保護(hù)作用。缺血性腦損傷的機(jī)制研究中8，9，興奮性氨基酸假說(shuō)、鈣超載相關(guān)假說(shuō)和自由基假說(shuō)

19、之間是相互聯(lián)系的。腦缺血時(shí)，首先是三磷腺苷耗竭，膜去極化，L型電壓門控鈣通道活化,Ca2內(nèi)流,促使谷氨酸大量釋放。后者結(jié)合突觸后膜受體引起NR過(guò)度激活，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2超載，激活包括磷脂酶在內(nèi)的Ca2靶酶，膜磷脂水解，經(jīng)代謝產(chǎn)生自由基，進(jìn)一步使質(zhì)膜和生物大分子破壞，導(dǎo)致缺血灶周邊區(qū)神經(jīng)元凋亡。腦缺血損傷時(shí)血小板活化因子合成顯著增多，已證實(shí)在缺血的神經(jīng)組織中血小板活化因子水平較正常高20倍，血小板活化因子通過(guò)使腦細(xì)胞內(nèi)鈣超載，參與一系列炎癥反應(yīng)，在缺血再灌注期產(chǎn)生自由基，使電解質(zhì)平衡和能量代謝發(fā)生障礙，通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化致生物膜裂解導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷，血腦屏障破壞，并可和其他細(xì)胞因子相互作用，加重腦細(xì)胞損傷。此外，血小板活化因子可使腦內(nèi)興奮性氨基酸增加，與突觸后的N甲基D天冬氨酸受體結(jié)合，引起Ca2超載，并可致Ca2內(nèi)流，加重腦細(xì)胞水腫，加重腦損傷。血小板活化因子還可引起腦血管收縮，使腦血量減少；能損傷內(nèi)皮細(xì)胞使血管通透性增加，血腦屏障通透性增高；能激活白細(xì)胞引起氧自由基及白三烯形成；有很強(qiáng)的促血小板聚集作用等，從而在腦缺血、繼