人轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)酶聯(lián)免疫分析

1、人轉(zhuǎn)化生長因子1(TGF-1)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用產(chǎn)品編號：CSB-E04725h檢測范圍：780 pg/ml - 50000 pg/ml最低檢測限：195 pg/ml特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人TGF-1，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。有效期：6個月預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中TGF-1含量。說明 1試劑盒保存：-20（較長時間不用時）；2-8（頻繁使用時）。2濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。 3中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。4剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水

2、樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。概述轉(zhuǎn)化生長因子-（transforming growth factor-,TGF-)是屬于一組新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細胞生長和分化的TGF-超家族。這一家族除TGF-外，還有活化素、抑制素、繆勒氏管抑制質(zhì)和骨形成蛋白。TGF-的命名是根據(jù)這種細胞因子能使正常的成纖維細胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)化，即在表皮生長因子（EGF）同時存在的條件下，改變成纖維細胞巾壁生長特性而獲得在瓊脂中生長的能力，并失去生長中密度信賴的抑制作用。TGF-與早先報道的從非洲綠猴腎上皮細胞BSC-1所分泌的生長抑制因子是同一物。1985年TGF-的基因克隆成功，并在大腸桿菌內(nèi)得到表達。在哺

3、乳動物至少發(fā)現(xiàn)有TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-12四個亞型。TGF-1與TGF-2有71%氨基酸同源性，TGF-1與TGF-3有77%同源性，TGF-2與TGF-3有80%同源性。TGF-與TGF-超家族其化成員有3040%同源性。機體多種細胞均可分泌非活性狀態(tài)的TGF-。一般在細胞分化活躍的組織常含有較高水平的TGF-，如成骨細胞、腎臟、骨髓和胎肝的造血細胞。TGF-1在人血小板和哺乳動物骨中含量最高；TGF-2在豬血小板和哺乳動物骨中含量最高；TGF-3以間充質(zhì)起源的細胞產(chǎn)生為主。實驗原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗TGF-1抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品

4、、生物素化的抗TGF-1抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TGF-1呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。 試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊（96孔）。 2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：2瓶(凍干品)。3. 樣品稀釋液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。4. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。5. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和

5、素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。6. 生物素標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：1×120ul/瓶（1：100）7. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：1×120ul/瓶（1：100）8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。需要而未提供的試劑和器材1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)

6、儀2. 高速離心機3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱4. 干凈的試管和Eppendof管5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，最好用多通道移液器6.蒸餾水，容量瓶等標(biāo)本的采集及保存 1. 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20或

7、-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。標(biāo)本的稀釋原則：首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細的記錄。最后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為50000 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋50000 pg/ml，25000 pg/ml，12500 pg/ml，6250 pg/ml，3120 pg/ml，

8、1560 pg/ml，780 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制25000 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）50000 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul生物素標(biāo)記抗體加990ul生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根

9、過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990ul辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。操作步驟實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)

10、板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37反應(yīng)120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100ul（取1ul生物素標(biāo)記抗體加99ul生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37,60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。 4. 每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100ul，37，60分鐘。5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每

11、孔，甩干。6. 依序每孔加底物溶液90ul，37避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。注：1. 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先

12、用此孔調(diào)OD值至零。 3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液或、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。計算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 注意事項1. 當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕