動態(tài)濁度法的建立及測定角膜真菌感染標(biāo)本的初步研究(1)

1、動態(tài)濁度法的建立及測定角膜真菌感染標(biāo)本的初步研究*(1)】 目的 建立動態(tài)濁度法，研究角膜真菌感染的檢測。方法 分別測定葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、真菌標(biāo)準(zhǔn)株(煙曲菌、串珠鐮刀菌和茄病鐮刀菌)及細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株(綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌)，測定19例臨床標(biāo)本。結(jié)果 葡聚糖的濃度時間曲線為雙曲線，時間反應(yīng)曲線顯示反應(yīng)速率較低。內(nèi)毒素的濃度時間曲線為直線，時間反應(yīng)曲線顯示反應(yīng)速率較高。三種真菌的濃度時間曲線和時間反應(yīng)曲線與葡聚糖的相似，革蘭陰性菌（綠膿桿菌）的濃度時間曲線和時間反應(yīng)曲線與內(nèi)毒素的相似，革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌）沒有反應(yīng)。臨床19例標(biāo)本，根據(jù)其濃度時間曲線和時間反應(yīng)曲線的形態(tài)，11例確診

2、為真菌感染，8例為革蘭陰性細(xì)菌曲線，為真菌和細(xì)菌的混合感染。結(jié)論 動態(tài)濁度法可用于角膜真菌感染的檢測，但對細(xì)菌-真菌混合感染不能確診?！娟P(guān)鍵詞】 動態(tài)濁度法；真菌；角膜；葡聚糖【Abstract】 Objective To establish the turbidimetric kinetic assay and study the measurement of fungus infection in corneal specimen.Methods Glucan， endotoxin， fungus(Aspergillus fumigatus， Fusariunmoniliforme and

3、 Fusariun solani) and bactiria(Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureaus) were measured. 19 clinic specimens were also measured.Results The concentration-time curve of glucan was hyperbolaand its time-reaction curve had low reaction rate. The concentration-time curve of endotoxin was beeline

4、 and its time-reaction curve had high reaction rate. The concentration-time curve and time-reaction curve of 3 fungi were same as that of glucan. The concentration-time curve and time-reaction curve of G- bacterium(Pseudomonas aeruginosa) were as same as that of endotoxin. The G bacterium(Staphyloco

5、ccus aureaus) had no reaction. According the concentration-time curve and time-reaction curve， 11 specimens were diagnosed fungi and 8 specimens were co-infection of fungi and bacteria.Conclusion Fungi infection in cornea could be diagnosed by turbidimetric kinetic method. Co-infection of fungi and

6、bacteria could not be diagnosed by this method.【Key words】 turbidimetric kinetic method；fungus；cornea；glucan角膜真菌感染的診斷較難，如不能及時治療，對患者造成損害，因此快速診斷非常必。真菌的診斷一般采用鏡檢和培養(yǎng)的方法，鏡檢較快，但漏檢率較高，真菌培養(yǎng)的方法，檢出率較高，但時間較長。我們使用鱟試劑與真菌的葡聚糖反應(yīng)的原理，建立動態(tài)濁度法并對角膜標(biāo)本進行真菌測定。1 材料與方法1.1 試劑 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(031222，規(guī)格：300g/ml)，鱟試劑（批號040532，靈敏度：0.25Eu/

7、ml）購自廈門鱟試劑廠，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（批號2002-7）和檢測用水(批號2003-3)購自中國藥品生物制品檢定所。1.2 儀器 BET-72細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀、振蕩器（天津大學(xué)無線電廠），超聲波處理器、離心機（Beckman公司）。1.3 葡聚糖和內(nèi)毒素的濃度-時間曲線1.3.1 葡聚糖 將其倍比稀釋為100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和 0.20g/ml，取其200l加入100l鱟試劑，振蕩30s，放入BET-72細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀測定，測定溫度為(371)。1.3.2 內(nèi)毒素 將其10倍稀釋為50、5、0.5、0.05和0.005EU/ml，按上述方

8、法測定。1.4 細(xì)菌、真菌標(biāo)準(zhǔn)株的測定 細(xì)菌包括革蘭陰性菌(綠膿桿菌)和陽性菌(金黃色葡萄球菌)，真菌包括煙曲菌、串珠鐮刀菌和茄病鐮刀菌。在培養(yǎng)基上取少量菌落，加入1ml檢測用水，超聲波處理min，2000cpm，min，取上清。用檢測用水將其按10倍稀釋，分別取200l加入100l鱟試劑，振蕩30s，BET-72細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀測定。1.5 標(biāo)本的處理 角膜標(biāo)本來自北京普仁醫(yī)院眼科，為臨床確診真菌性角膜炎后，進行角膜移植，將角膜標(biāo)本用檢測用水沖洗后，在潔凈臺中將其剪碎，加入1ml檢測用水超聲波處理min，cpm，min，取上清備用。1.6 標(biāo)本的測定和結(jié)果的確定 共檢測臨床診斷真菌的感染的角

9、膜標(biāo)本19例，標(biāo)本處理后，用檢測用水將其按10倍稀釋8個稀釋度，分別取200l加入100l鱟試劑，振蕩30s，放入BET-72細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀測定。根據(jù)標(biāo)本的濃度-時間曲線、時間反應(yīng)曲線和時間速率曲線確定。1.7 BET-72細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀的檢測指標(biāo) 內(nèi)毒素或葡聚糖與鱟試劑中的B、C或G因子反應(yīng)，形成凝膠，記錄不同濃度的內(nèi)毒素或葡聚糖在反應(yīng)過程中不同時間的光密度值，確定OD值達到0.02的反應(yīng)時間為測定反應(yīng)時間，以反應(yīng)時間為縱坐標(biāo)，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，做圖，成為濃度時間曲線。時間反應(yīng)曲線為某一濃度的內(nèi)毒素或葡聚糖在不同時間的OD值，以時間為橫坐標(biāo)，以樣品的OD值為縱坐標(biāo)，做圖。時間速率曲線為

10、某一濃度的內(nèi)毒素或葡聚糖在不同時間的反應(yīng)速率，以時間為橫坐標(biāo)，以樣品的反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)，做圖。2 結(jié)果2.1 葡聚糖的濃度時間曲線 葡聚糖的濃度時間曲線為雙曲線（圖1），低濃度時，反應(yīng)時間較長，隨濃度的增加，反應(yīng)時間減少，到達最低點后，反應(yīng)時間隨濃度的增高而增加。時間反應(yīng)曲線顯示，反應(yīng)開始時，反應(yīng)速率較低，曲線形態(tài)如“S”型。時間速率曲線顯示，不同濃度的葡聚糖的最大反應(yīng)速率大部分在10002000s的時間范圍內(nèi)。 圖1 葡聚糖時間-濃度曲線2.2 內(nèi)毒素的濃度時間曲線 內(nèi)毒素的濃度時間曲線為直線（圖2），反應(yīng)時間隨內(nèi)毒素濃度的增高而減少。時間反應(yīng)曲線顯示，反應(yīng)開始時，反應(yīng)速率較高，曲線形態(tài)如同

11、“倒L”型。時間速率曲線顯示，不同濃度內(nèi)毒素的最大反應(yīng)速率大部分在5001000s時間范圍內(nèi)。作者：劉宏偉，王香蘭，彭淑玲，周 毅【摘】目的建立動態(tài)濁度法，研究角膜真菌感染的檢測。方法分別測定葡聚糖標(biāo) 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。圖2 內(nèi)毒素時間-濃度曲線2.3 真菌標(biāo)準(zhǔn)株的結(jié)果 煙曲菌、串珠鐮刀菌和茄病鐮刀菌的濃度時間曲線、時間反應(yīng)曲線和時間速率曲線與葡聚糖的相似。2.4 細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株的結(jié)果 綠膿桿菌的濃度-時間曲線、時間反應(yīng)曲線和時間速

12、率曲線與內(nèi)毒素的相似。金葡萄球菌不能做出濃度時間曲線、時間反應(yīng)曲線和時間速率曲線。2.5 臨床標(biāo)本的檢測 檢測的19例臨床標(biāo)本，根據(jù)濃度時間曲線、時間反應(yīng)曲線和時間速率曲線，其中11例為真菌感染，有8例為細(xì)菌曲線，由于所有標(biāo)本真菌培養(yǎng)陽性，為真菌和細(xì)菌混合感染。3 討論真菌性角膜炎是嚴(yán)重的致盲眼病，主以鐮刀菌、曲霉菌、假絲酵母菌等感染為主1，2，近年發(fā)病率不斷增多，發(fā)現(xiàn)戴軟鏡者3和激光手術(shù)后患者也有發(fā)病4，此病由于難以確診（真菌培養(yǎng)需10天）延誤治療，以至引起失明，甚至喪失眼球。人們尋找快速診斷真菌感染的方法，鱟血提取液中的G-因子，可被真菌細(xì)胞壁特有成分(13) beta-D-glucan（

13、葡聚糖）激活后經(jīng)過顯色或凝集反應(yīng)進行檢測，可做真菌的定性和定量試驗，稱為G因子法。動態(tài)濁度法已在2005版藥典中用于對內(nèi)毒素的測定5，它是檢測反應(yīng)混合物的濁度到達某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需的反應(yīng)時間，我們用此方法分別測定內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、真菌標(biāo)準(zhǔn)株及細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株，并測定19例臨床標(biāo)本。臨床標(biāo)本是經(jīng)培養(yǎng)確診為真菌感染，根據(jù)我們實驗的濃度時間曲線、時間反應(yīng)曲線和時間速率曲線的形態(tài)，11例為真菌，8例為細(xì)菌的圖形，可能為真菌和細(xì)菌的混合感染。8例不能確診是由于鱟試劑中有G、B和C因子，B、C因子用于測定細(xì)菌，G因子用于測定真菌，細(xì)菌測定比真菌敏感，當(dāng)兩者混合時，只能測定出細(xì)菌。多粘菌素已用于抑

14、制內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)6，我們用多粘菌素來抑制BC因子的活性，由于多粘菌素純度不高，混有內(nèi)毒素，結(jié)果不理想。革蘭陽性菌不影響檢測，革蘭陰性菌影響檢測。真菌的細(xì)胞壁較為堅固，我們對真菌標(biāo)準(zhǔn)品和臨床標(biāo)本處理時，采用超聲的方法，以破壞真菌的結(jié)構(gòu)。有學(xué)者從真菌中提取出葡聚糖7。G因子法已用于測定間質(zhì)性漿細(xì)胞肺炎血中的葡聚糖8，它可檢測小鼠念珠菌病9和檢測臨床病人深層真菌感染10。文獻報道，1ng1g葡聚糖與G因子可產(chǎn)生凝集反應(yīng)11，與我們的結(jié)果相似。我們的實驗顯示產(chǎn)生反應(yīng)的葡聚糖的濃度較高，為200ng100g，可能與鱟試劑的敏感性不同有關(guān)。真菌或含有真菌的標(biāo)本以10倍稀釋，至少有34個濃度凝集反應(yīng)顯著，

15、而細(xì)菌在8個稀釋度中都有反應(yīng)，另外真菌和革蘭陰性細(xì)菌的時間反應(yīng)曲線和時間速率曲線不同，用此方法可檢測標(biāo)本的真菌感染。我們將進一步分離G和B、C因子，進行特異性反應(yīng)，可排除細(xì)菌對真菌檢測的影響。 【參考文獻】1 Thomas. Current perspectives on ophthalmic mycoses. Clin Microbiol Rev， 2003， 16：730-797.2 王麗婭.我國真菌性角膜炎的研究現(xiàn)狀.眼科，2005，14：143-144.3 Salierno， Goldstein Driebe. Fungal ring infiltrates in disposable

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17、kinetic assay with Limulus amebocyte lysate. Chem Pharm Bull (Tokyo)， 1990，38：2523-2526.7 Williams， McNamee， Jones， et al. A method for the solubilization of a (13)-beta-D-glucan isolated from Saccharomyces cerevisiae. Carbohydr Res， 1991，219：203-213.8 Yasuoka， Tachikawa， Shimada， et al. (13) beta-D

18、-glucan as a quantitative serological marker for Pneumocystis carinii pneumonia. Clin Diagn Lab Immunol， 1996， 3：197-199.9 Nichterlein， Buchheidt， Hein， et al. Comparison of glucan detection and galactomannan enzyme immunoassay in gastrointestinal and systemic murine candidiasis. Diagn Microbiol Infect Dis， 2003， 46：103-108.10 Ostrosky-Zeichner， Alexander， Kett， et al. Multicenter clinical evaluation of the (13) beta-D-glucan assay as an aid to diagnosis of funga