人體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞冷凍干燥的探索性實(shí)驗(yàn)(1)

1、    人體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞冷凍干燥的探索性實(shí)驗(yàn)(1)    人體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞已成為組織工程、細(xì)胞移植和基因治療等領(lǐng)域的重研究對(duì)象,目前對(duì)它已有低溫保存的研究,而通過冷凍干燥的方法對(duì)其進(jìn)行保存國(guó)內(nèi)外未見報(bào)導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)嘗試用凍干的方法來保存骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。文中選取海藻糖、等作保護(hù)劑,應(yīng)用差示掃描量熱儀()測(cè)量其結(jié)晶溫度和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度;隨后對(duì)加入保護(hù)劑的細(xì)胞溶液進(jìn)行凍干實(shí)驗(yàn),并應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)凍干樣品復(fù)水后的細(xì)胞活性進(jìn)行了測(cè)定,其中30% 20%海藻糖對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效果較好,細(xì)胞成活率達(dá)到16.40%。 關(guān)鍵詞：熱工學(xué) 冷

2、凍干燥 人體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 凍干保護(hù)劑     1前言骨髓中含有兩類組織成份:造血干細(xì)胞及其分化的子代細(xì)胞,和結(jié)締組織(被稱為基質(zhì))。在基質(zhì)中除了存在著無成骨性的脂質(zhì)細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞外,還有一種獨(dú)立的細(xì)胞系基質(zhì)干細(xì)胞(,)。它是一種成纖維細(xì)胞樣的梭型貼壁細(xì)胞,與造血干細(xì)胞一樣具有多分化潛能,因而日益受到人們的關(guān)注。在特定的條件下,骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可以分化形成成骨細(xì)胞()、軟骨細(xì)胞()、成肌細(xì)胞()和神經(jīng)細(xì)胞()1.2。易于獲得、特性穩(wěn)定,是組織工程中理想的種子細(xì)胞,有很好的應(yīng)用前景。它的廣泛應(yīng)用使其保存問題備受關(guān)注。目前,多采用-196

3、的深低溫保存3,但液氮費(fèi)和管理費(fèi)用相當(dāng)昂貴,所以有必探索新的保存方法。冷凍干燥技術(shù)是在低溫真空下干燥制品,干燥后體積、形狀基本不變,物質(zhì)呈海綿狀,無干縮;復(fù)水時(shí)能夠迅速還原成原來的性狀;能夠除去物質(zhì)中90%以上的水分,制品的保存期長(zhǎng),而且在保存過程中可以置于室溫下保存;且便于長(zhǎng)途運(yùn)輸。由于以上這些無可比擬的優(yōu)越性,凍干保存倍受人們的關(guān)注,但由于活體細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,對(duì)其凍干保存一直是尚未解決的難題,仍然處于探索階段46。對(duì)人體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行凍干實(shí)驗(yàn)研究,選取了幾種保護(hù)劑,并應(yīng)用差示掃描量熱儀()對(duì)加入不同保護(hù)劑的細(xì)胞懸液的結(jié)晶溫度以及其最大濃縮玻璃化轉(zhuǎn)變溫度進(jìn)行了測(cè)定;隨后對(duì)樣品進(jìn)行冷凍干

4、燥實(shí)驗(yàn);并應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)凍干結(jié)果進(jìn)行了活性檢測(cè)。2保護(hù)劑的選取與配制2.1保護(hù)劑的選取在許多生物制品的冷凍干燥過程中,常常采用低聚糖,尤其是二糖作為保護(hù)劑。這是因?yàn)槎羌饶茉趦鼋Y(jié)過程中起到低溫保護(hù)劑的功能,又能在干燥脫水過程中起到脫水保護(hù)劑的作用。在生物制品的冷凍干燥配方中,海藻糖較常用,它具有較好的保護(hù)能力,對(duì)于海藻糖的保護(hù)機(jī)理,等認(rèn)為7:(1)海藻糖的水合分子半徑比其它糖(如蔗糖、葡糖糖)大2.5倍,這使得它的水合分子獨(dú)立于被保護(hù)的蛋白質(zhì)的水合分子之外,從而起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)、保護(hù)細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)重的膜結(jié)構(gòu)的作用;(2)海藻糖能夠降低干態(tài)膜脂的熔點(diǎn),從而避免了在復(fù)水過程中膜的相變;(3)海藻糖

5、能夠形成穩(wěn)定的二水化合物。在有少量水分存在時(shí),這些二水化合物能防止水分與未水合的海藻糖結(jié)合,從而保持較高的玻璃化溫度。這樣凍干后的樣品即便在較為潮濕的環(huán)境中也可保存較長(zhǎng)時(shí)間。由于多元醇與糖的官能團(tuán)都是羥基,通常認(rèn)為多元醇在生物制品的冷凍干燥過程能起到保護(hù)作用。另外,聚合物能夠提高生物制品混合溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度等有利因素,因而在有些生物制品的配方中常常含有各種聚合物類保護(hù)劑。所以本文選用海藻糖、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮()、羥乙基淀粉()和牛血清()等作為保護(hù)劑。2.2保護(hù)劑的配制實(shí)驗(yàn)中所采用的人體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞由上海市組織工程研究與開發(fā)中心提供。選用的幾種實(shí)驗(yàn)材料如下:聚乙烯吡咯烷酮30(30

6、,上海);甘露醇(上海);6%羥乙基淀粉注射液(,北京);海藻糖(上海);小牛血清(,美國(guó))。首先配制不同濃度的組分:(30%,40%,50%/);海藻糖(20%/);甘露醇(10%/),然后將各組分按照一定的配比滴注到細(xì)胞懸液中,同時(shí)振蕩搖勻,配制成的細(xì)胞溶液具體如下表(為單純的細(xì)胞懸液):3應(yīng)用測(cè)量保護(hù)劑參數(shù)為了防止在凍干過程中受損傷,我們一般希望將樣品冷卻到玻璃化轉(zhuǎn)變溫度()之下,并在此溫度下進(jìn)行干燥。還有另外一個(gè)重參數(shù),即最大凍結(jié)濃縮玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(),它也是冷凍干燥中需了解的最重的參數(shù),對(duì)于制定冷凍干燥工藝和產(chǎn)品質(zhì)量的預(yù)測(cè)具有重意義8,9,而則是研究物質(zhì)玻璃化轉(zhuǎn)變的最現(xiàn)代的設(shè)備。實(shí)驗(yàn)

7、中使用的(,差示掃描量熱儀)是-(美國(guó)-公司)。其基本思想是在樣品和參比始終保持相同溫度的條件下,測(cè)定為滿足此條件樣品和參比兩端所需的能量差,并直接作為信號(hào)(熱量差)輸出。的熱流曲線記錄的是輸入到樣品和參比的功率差。這個(gè)設(shè)備的冷卻方式為液氮冷卻,樣品沖洗氣體為高純度氦氣(純度>99.999%),流量為25/。為避免爐塊結(jié)霜,加樣時(shí)用高純度氮?dú)鉀_洗爐塊。樣品皿為標(biāo)準(zhǔn)液體鋁皿,用液固通用壓機(jī)(美國(guó)-公司)壓制。樣品皿使用前,用無水乙醇浸泡以除去表面可能存在的污物,然后用純水清洗并烘干后備用。在降溫相變過程中采用型基線,以消除基線誤差。實(shí)驗(yàn)分別測(cè)量了、七種溶液的結(jié)晶溫度和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度:將壓制

8、好的細(xì)胞溶液樣品以20/從10降溫到-60;并保持30;然后再以20/從-60升溫到10。得出各樣品的降溫與升溫全過程熱流曲線和玻璃化段的熱流曲線,選取部分示于圖1-4:將實(shí)測(cè)的結(jié)果列于表2:由表2可得:在實(shí)驗(yàn)條件下,單純的細(xì)胞懸液的結(jié)晶溫度為-19.13,它沒有明顯的玻璃化轉(zhuǎn)變。而在中加入1份20%的海藻糖,以及濃度分別為30%、40%和50%的兩份后(,),可以較明顯的看出玻璃化轉(zhuǎn)變。樣品,的結(jié)晶溫度分別為-7.17、-17.53和-19.63,但玻璃化轉(zhuǎn)變溫度卻沒有發(fā)生較大的變化;沒有明顯的玻璃化轉(zhuǎn)變;(在中加入甘露醇)出現(xiàn)玻璃化轉(zhuǎn)變,可見甘露醇有利于玻璃化的形成;(在中加入小牛血清)也

9、出現(xiàn)玻璃化轉(zhuǎn)變,與相比,結(jié)晶溫度升高,而變化不大,均為-35左右。由上表可以看出,不同濃度的溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高于溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,即形成玻璃的能力強(qiáng)于。            摘人體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞已成為組織工程、細(xì)胞移植和基因治療等領(lǐng)域的重研究對(duì)象,目前對(duì)它已有低溫保存的         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)

10、用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。    4凍干實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用美國(guó)冷凍干燥機(jī)對(duì)細(xì)胞溶液進(jìn)行冷凍干燥。另外,為了采集凍干過程中的溫度,在此系統(tǒng)上加裝了實(shí)測(cè)物料、冷阱和隔板溫度的熱電偶溫度計(jì),以及溫度數(shù)據(jù)自動(dòng)采集記錄裝置。但由于該凍干機(jī)的控制面板尚存在問題,無法精確控制干燥溫度,因此干燥過程中隔板的溫度過高。冷凍干燥可分為預(yù)凍結(jié)和升華干燥與解析干燥三個(gè)過程,在預(yù)凍結(jié)過程應(yīng)該使細(xì)胞溶液的溫度低于結(jié)晶溫度和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,所以在試驗(yàn)中將其凍結(jié)到-40,時(shí)間為1.5。隨后對(duì)樣品進(jìn)行干燥,整個(gè)凍干過程持續(xù)時(shí)間為44小時(shí)

11、,此過程中各點(diǎn)溫度的變化情況,即凍干曲線,示于圖5:5凍干細(xì)胞活性的測(cè)定細(xì)胞的活性可以通過測(cè)定細(xì)胞碘化丙錠()拒染率來確定。染色是根據(jù)細(xì)胞凋亡時(shí)在細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子水平上所發(fā)生的特征性改變,通過各種染色體熒光染料對(duì)凋亡細(xì)胞可染性發(fā)生的改變及凋亡細(xì)胞形態(tài)上的改變影響細(xì)胞的光散色特性等原理檢測(cè)細(xì)胞凋亡和存活率。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞儀(中科院上海細(xì)胞所)對(duì)凍干樣品分別進(jìn)行了染色活性鑒定。圖6和圖7分別為樣品、的活性檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達(dá),其中軸為測(cè)量強(qiáng)度,軸為細(xì)胞數(shù)目。上面的方格為,表示被染色的細(xì)胞;下面的方格為,表示未被染色的細(xì)胞。為所測(cè)細(xì)胞數(shù),為其所占比率?？偨Y(jié)各樣品的活性檢測(cè)結(jié)果,示

12、于表4:由各樣品的流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果可知,樣品(30% 20%海藻糖 細(xì)胞懸液)凍干后骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的存活率最高,為16.40%。而隨著濃度的升高,如樣品(40% 20%海藻糖 細(xì)胞懸液)、(50% 20%海藻糖 細(xì)胞懸液),細(xì)胞存活率逐漸降低。同時(shí)從表中可分析出對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效果優(yōu)于,且加入甘露醇和小牛血清均可提高細(xì)胞的存活率。將細(xì)胞存活率與各樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度相聯(lián)系,可以看出沒有玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的樣品(6% 20%海藻糖 細(xì)胞懸液)凍干后細(xì)胞的存活率很低。而、的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度相對(duì)、較高,同時(shí)對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率也較高?？梢?玻璃化轉(zhuǎn)變溫度與凍干的結(jié)果是相關(guān)的。6結(jié)論通過冷凍干燥的方法對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行保存至今未見報(bào)導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)嘗試對(duì)人體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行冷凍干燥。選取海藻糖、等作保護(hù)劑,應(yīng)用差示掃描量熱儀()測(cè)量其結(jié)晶溫度和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,對(duì)凍干進(jìn)行探索性研究,其中保護(hù)劑的組成、濃度、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以及凍干過程各因素都對(duì)細(xì)胞的存活率有影響。在實(shí)驗(yàn)條件下,30% 20%海藻糖對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效果較好,細(xì)胞成活率達(dá)到16.40%,表明探索骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的冷凍干燥是有希望的。由于實(shí)驗(yàn)所用的凍干機(jī)仍然不能精確控制干燥溫度,在干燥過程中隔板的溫度過高,細(xì)胞存活率還不夠理想,有望在改進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)備后得到提高。參考文獻(xiàn)1.,1997,276