復方丹參方的藥效物質(zhì)及作用機理研究分享

1、真誠為您提供優(yōu)質(zhì)參考資料，若有不當之處，請指正。復方丹參方的藥效物質(zhì)及作用機理研究張伯禮1 王永炎2 高秀梅1 商洪才1 孫有富2 王義明3潘桂湘1 郭利平1 胡利民1 王 怡1 張 萌1 劉密新3 趙宜軍2（1. 天津中醫(yī)學院 300193；2. 中國中醫(yī)研究院 100700；3. 清華大學 100084）摘要：中醫(yī)藥治病的原則是“調(diào)整陰陽，以平為期”。以方劑為載體，注重整體，采用辨證論治的方法，進行綜合治療的思想符合現(xiàn)代治療學的發(fā)展趨勢。然而中醫(yī)藥缺乏對藥效物質(zhì)的微觀分析和作用機理的科學闡釋，成為影響中醫(yī)藥迅速發(fā)展的瓶頸。因此，以復方丹參方為范例，從方劑的配伍配比、作用機理、藥效物質(zhì)等方面

2、進行系統(tǒng)的研究，不僅證實了復方丹參方多組分、多靶點治療心血管病假說的科學性，而且為經(jīng)典處方的二次開發(fā)提供了一種模式。本項工作將豐富現(xiàn)代藥物治療學，促進方劑配伍的科學詮釋，開拓中藥新藥創(chuàng)制新思路，構建創(chuàng)新中藥的理論基礎。關鍵詞：復方丹參方 藥效物質(zhì) 作用機理 配伍配比方劑是一個復雜體系，方劑作用的人體也是一個復雜系統(tǒng)。面對雙重復雜系統(tǒng)，要想認識它，必須將復雜系統(tǒng)中非線性規(guī)律部分降解為線性規(guī)律去研究，多個線性規(guī)律的綜合有助于復雜系統(tǒng)的認識，因此研究方劑必須遵循“復雜簡單復雜”的原則，發(fā)揮自身的綜合優(yōu)勢，保持中藥原方的配伍特點，同時借鑒西藥的“分析”方法，通過有效組分的配伍配比規(guī)律研究，最終構建藥效

3、組分基本清楚，作用靶點及原理基本清楚，高效低毒的現(xiàn)代中藥。作為藥典方，復方丹參的生產(chǎn)廠家較多，且沒有合理的質(zhì)控標準，制劑呈現(xiàn)多樣性。同時各種劑型使用丹參和三七不同的有效組分，導致了臨床療效差異，而且丹參、三七、冰片不同組分在心肌缺血病理環(huán)節(jié)中各自的作用亦不明確，影響了復方丹參方的作用發(fā)揮。我們以復方丹參為基礎方，進行了藥效物質(zhì)、配伍配比及作用機理的研究。研究內(nèi)容：1 明確丹參、三七在全成分、有效組分層次的配伍配比規(guī)律。配伍配比是方劑的核心與靈魂所在，是中醫(yī)藥的特色和優(yōu)勢，它既不是簡單的藥物作用在數(shù)量上的相加，也不是機械的毒副反應的抵消，而是在辨證立法基礎上，以法統(tǒng)方，立方遣藥，有序組合而成的有

4、制之師。1.1 丹參、三七全成分的配伍配比規(guī)律研究【1，2】優(yōu)選丹參/三七最佳配比是本項研究的主要內(nèi)容。在進行飲片（全成分）層次配伍研究的同時，為組分配伍研究提供技術平臺和方法學基礎，為效應明確小復方的二次開發(fā)提供一種模式，同時為研制現(xiàn)代中藥提供科學依據(jù)。在整體水平上，應用犬冠狀動脈左前降支結(jié)扎法造成急性心肌缺血模型，并與血流動力學模型有機結(jié)合，著眼于全成分、整體動物、多效應指標動態(tài)觀察，建立了基線等比增減設計方法，對丹參/三七的不同比例： 10/0、10/1、10/3、10/6、10/10、1/10、0/10進行了多效應比較藥效學研究。效應評價指標涉及到心外膜心電圖（-ST、N-ST ）、心

5、肌組織缺血區(qū)范圍、心肌生化標志物（cTnI、CK-MB）、冠脈血流量、心肌耗氧量、血流動力學、一氧化氮、內(nèi)皮素、自由基等。結(jié)果表明：1. 以丹參為主的藥對比例組，即10/6、10/3、10/1、10/0，有明顯改善犬心肌缺血的作用，減輕由心外膜心電圖所標測的心肌缺血程度，減少通過TTC染色所顯示的缺血區(qū)。2. 以丹參為主的藥對比例組對心肌鈣蛋白的增高有明顯的抑XXX用，反映了丹參對心血管的直接作用強于三七。這與心外膜心電圖、心肌染色所反映的結(jié)果基本一致。3. 在對冠脈血流量有效增加的各組中，以丹參為主的藥組（10/0、10/3、10/6）作用較強。消心痛組在給藥后30min即發(fā)揮作用，但很快減

6、弱；而中藥組（10/0、10/3、10/6）作用平穩(wěn)而持久、穩(wěn)中有升，遠后效應明顯。4.10/6、10/3兩組可以明顯改善左室收縮及舒張功能，增加心輸出量及心臟指數(shù)，減少血管總外周阻力，而左室做功沒有明顯增加，心率、平均動脈壓的波動較小。5.0/10組（單純?nèi)撸┘却龠MNO的釋放、保護SOD活性，又降低ET含量、減少MDA的產(chǎn)生，表現(xiàn)出較強的生物效應。在細胞水平上，應用心臟微血管內(nèi)皮細胞（CMEC）模型，對丹參、三七的上述7種比例進行了研究，其指標涉及到MTT、LDH、NO、ET等。結(jié)果表明：1.在正常培養(yǎng)條件下，丹參可促進CMEC增殖，三七反之，配比隨著丹參量的減少和三七量的加大增殖效果減弱

7、；對于NO和ET均有降低趨勢，但無統(tǒng)計學意義。 2.在缺O(jiān)2損傷條件下，丹參促進CMEC增殖，三七反之，配比在101106范圍內(nèi)，隨三七量加大，促進CMEC增殖趨勢明顯。而在1010010范圍內(nèi)，隨丹參量的減少，三七量的加大，CMEC增殖趨勢減弱，各配比組均可顯著降低NO釋放（除106 P>0.05外均P<0.01），且有降低ET分泌水平的趨勢，而尤以101和106效果最佳。 1.2 丹酚酸B、丹參酮A組分配伍配比規(guī)律研究【3】丹參作為復方丹參方中的君藥，具有重要的藥理作用。丹參的主要水溶性物質(zhì)丹酚酸B、脂溶性提取物丹參酮A有各自的藥理活性，兩者配伍后有何藥效變化；針對不同的體外培

8、養(yǎng)細胞：CMEC、心肌細胞（CM），兩者又有何不同的作用重點；對于心臟的保護作用，兩者配伍后的最佳比例是多少,都是有待回答的問題。研究以丹酚酸B、丹參酮A為配伍，以缺氧、腫瘤壞死因子（TNF-）為刺激因素，心臟微血管內(nèi)皮細胞（CMEC）、心肌細胞（CM）為靶細胞，觀察不同配伍后的藥效變化并從中尋找二者作用的最佳比例和各自的作用靶點及機制。結(jié)果表明：.CMEC缺氧損傷時，各配比組均可提高CMEC活力，降低LDH釋放，丹酚酸B、丹參酮A配伍后的作用優(yōu)于單一藥物，且以28組最顯著；各配比組均有降低NO合成、ET釋放的趨勢。.CMEC被TNF-損傷時，各配比組均可提高CMEC活力，降低LDH釋放，丹酚

9、酸B與丹參酮A配伍后的作用強于單一藥物，且以55組為最佳；各配比組均有增加SOD活性，減少MDA產(chǎn)量的趨勢，丹參酮A抗氧化損傷的能力最強。丹參酮A提高NO合成、減少ET的釋放的作用最顯著。.CM缺氧損傷時，各配比組對CM增殖的作用不明顯，但丹酚酸B的作用強于丹參酮A；丹酚酸B、丹參酮A配伍后減少LDH釋放、NO合成的作用強于兩者單獨使用，且以55的比例為最佳。.CM被TNF-損傷時，各配比組均能明顯減輕細胞的損傷程度，表現(xiàn)在細胞活力增強，LDH釋放的減少，保護作用以82組最佳，55組次之；各配比組均有升高SOD，減少MDA的作用，丹參酮A減少MDA的作用最強。2 明確丹參、三七、冰片全成分、有

10、效組分治療心肌缺血的途徑、靶點及整合調(diào)節(jié)作用規(guī)律。復方丹參治療心肌缺血有較為系統(tǒng)的研究，一般認為其有擴冠、降低心肌耗氧量、抗血小板聚集等作用，但目前的研究工作不足以揭示臨床治療機制，其深層次的作用機理研究更少。已知其抗心肌缺血的機理不同于硝酸酯類化合物的釋放外源性一氧化氮使冠脈擴張，但其通過何種途經(jīng)發(fā)揮對缺血心肌的保護作用，其整合調(diào)節(jié)如何體現(xiàn)，是一個值得探討的問題。2.1 復方丹參方預處理加強缺血預適應心肌保護作用及機制研究【4】1986年Murry提出心肌缺血預適應（Ischemic preconditioning, IPC）現(xiàn)象為心肌細胞保護及機理探討開辟了新領域，90年代受到廣泛重視，并

11、開展了藥物預適應研究。多數(shù)中藥發(fā)揮作用的途徑不同于西藥的直接對抗和補充，而在于整合調(diào)節(jié)。復方丹參方治療心肌缺血是否因其激活內(nèi)源性保護物質(zhì)而發(fā)揮作用，尚不知曉。采用大鼠在體預適應模型，觀察了復方丹參方模擬和加強缺血預適應心肌保護作用及機制。結(jié)果表明：再灌組、早晚期假性預適應組壞死重量占缺血重量（IS/AAR）分別高達45、47、45；心律失常發(fā)生率也分別高達76.46、55.56、73.33；血清中LDH含量也顯著高于對照組，P<0.01。缺血預處理后，IPC早期組IS/AAR與早期假性預適應組相比降低了17，晚期IPC組IS/AAR與晚期假性預適應組相比僅降低4；早期IPC和晚期IPC組

12、心律失常發(fā)生率分別為11.76、43.75，顯著低于再灌和早晚期假性預適應組，p<0.01；IPC后LDH釋放也減少。說明缺血預適應可縮小缺血范圍，減少心律失常的發(fā)生率。復方丹參方預處理后，在再灌、IPC基礎上IS/AAR進一步縮小約1017，LDH釋放也減少，LDH含量以晚期藥物IPC組最低，與晚期假性預適應組相比，P<0.05，但復方丹參方對心律失常的影響不明顯。另外復方丹參方預處理后，還可使血清中MDA下降，SOD活性增強。通過免疫組化和RT-PCR方法研究發(fā)現(xiàn)，復方丹參預處理后可以使早、晚期IPC組和再灌組的心肌細胞iNOS、PKCmRNA和蛋白表達明顯加強，p<0.

13、05，對再灌HSP70表達也有增加趨勢。2.2 丹酚酸B預處理的心臟細胞保護作用及機制研究【5，6】80年代，對丹參水溶性成分進行了系統(tǒng)研究，分離得到多種酚酸類化合物，在丹參水溶性酚酸類化合物中丹酚酸B的含量最高，因此，我們在心臟微血管內(nèi)皮細胞（CMEC）和心肌細胞（CM）培養(yǎng)成功的基礎上，基于缺氧預適應（HPC）機制，建立缺O(jiān)2/復O2損傷的細胞模型，以細胞活力（MTT）、乳酸脫氫酶（LDH）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、內(nèi)皮素（ET）等生化指標及超微結(jié)構變化為評價標準，觀察了丹酚酸B預適應的細胞保護效應；并采用以蛋白激酶C（PKC）抑制劑chelerythrine、KATP

14、通道阻滯劑優(yōu)降糖為工具藥的方式，在對內(nèi)源性保護物質(zhì)PKC、熱休克蛋白70（HSP70）的mRNA表達影響上，探討了丹酚酸B預處理細胞保護的分子生物學機制。結(jié)果表明：1.在正常培養(yǎng)條件下，丹酚酸B可明顯提高CMEC和心肌細胞的細胞存活率和SOD活性、降低LDH活性、維持正常的形態(tài)超微結(jié)構，有降低CMEC的ET分泌和NO釋放趨勢。2.缺O(jiān)2預適應可增強細胞對隨后較長時間缺O(jiān)2/復O2損傷的耐受性，表現(xiàn)為可提高細胞存活率和SOD活性，降低LDH活性，而且能明顯降低CMEC因缺O(jiān)2/復O2導致的ET和NO水平升高，同時明顯改善其形態(tài)超微結(jié)構變化。3.丹酚酸B預適應具有與缺O(jiān)2預適應相似的細胞保護效應，

15、對于CMEC表現(xiàn)為早期保護和延遲保護兩個時相。4.KATP通道阻滯劑優(yōu)降糖不能消除HPC的CMEC保護作用，選擇性PKC抑制劑chelerythrine消除了HPC的CMEC保護效應，丹酚酸B預適應可以使CMEC被PKC抑制劑阻斷的HPC效應重現(xiàn)。5.在早期預適應中，丹酚酸B預適應可促進缺O(jiān)2/復O2損傷CMEC的HSP70 mRNA、PKC mRNA表達增強，且明顯優(yōu)于HPC；在晚期預適應中，丹酚酸B預適應同樣促使HSP70 mRNA表達增強，且與HPC具有疊加效應。3 明確復方丹參方藥效物質(zhì)基礎，化學成分指紋譜及質(zhì)控標準，為中藥質(zhì)量提高和知識產(chǎn)權保護提供技術壁壘。方劑的藥效物質(zhì)基礎不是某一

16、單純成分，而是復雜的混合物，因此必須結(jié)合藥理學對方劑藥效物質(zhì)降解分析，進行有效組分和有效成分的化學篩選，建立規(guī)范的提取方法，進行有效成分的指紋圖譜識別和指標成分的定量分析，在主要藥效學導向下，制定藥材和方劑的質(zhì)控標準。選擇復方丹參方中的10個成分作為指標【7，8】：丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1，采用高效液相色譜法對給藥前后復方丹參方中丹參水溶性成分、脂溶性成分及三七皂苷類成分進行含量測定。根據(jù)這些成分理化性質(zhì)間的差異，建立了色譜條件。對丹參、三七各配比（生藥量之比：10/0、10/1、10/3、10/6

17、、10/10、1/10、0/10）組方中主要成分的含量及穩(wěn)定性進行測定和考察。在此基礎上還對大鼠灌服復方丹參方后血清中的丹參素、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1進行檢測和藥物動力學研究。研究結(jié)論： 1. 復方丹參方不僅具有抗心肌缺血的作用，而且有增強缺血預適應效果。作用機制可能是擴冠和激活內(nèi)源性保護物質(zhì)的釋放。 2. 丹參的作用靶點側(cè)重于血管，其擴張冠脈的效應強于三七；三七的作用靶點側(cè)重于心肌，其對缺氧心肌的保護作用強于丹參； 3. 結(jié)合化學結(jié)果分析得出：二者配伍后存在協(xié)同互補效應，三七皂苷類成分可使丹參水溶、脂溶成分的含量穩(wěn)定。丹參水溶性成分吸收入血較快（藥后30min），擴冠效應強，更適于速

18、效；而丹參脂溶性成分和三七皂苷類成分吸引入血較慢（藥后60min），遠后效應明顯，更適宜長效。 4. 丹酚酸B與丹參酮IIA均有抗心肌缺血的作用，但各有側(cè)重。5. 復方丹參方中丹參的水溶性成分以丹酚酸B含量為最高，其次是丹參素、原兒茶醛；丹參脂溶性成分的含量高低依次為隱丹參酮、丹參酮A、丹參酮I；三七皂苷類成分則以人參皂苷Rg1含量為最高，其次是人參皂苷Rb1、三七皂苷R1，再次為人參皂苷Re。6. 復方丹參方中各類成分的穩(wěn)定性是三七皂苷類成分強于丹參水溶性成分，而水溶性成分的穩(wěn)定性又優(yōu)于脂溶性成分。復方丹參方配比不同時，同類成分間的穩(wěn)定性有所差異，其穩(wěn)定性隨著三七在處方中所占比例的增大而呈增

19、強的趨勢，說明復方丹參方中各主要成分的含量及穩(wěn)定性與配伍配比存在一定的相關性。7. 建立的方法可作為復方丹參方各主要成分的質(zhì)量控制標準，復方丹參方中的丹酚酸B、丹參素、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1可經(jīng)胃腸道吸收入血，提示可能為主要藥效成分。 展望：方劑的現(xiàn)代化研究是一項復雜而艱巨的系統(tǒng)工程。要完成表征現(xiàn)代化（工藝、質(zhì)控、包裝）相對容易，而內(nèi)涵現(xiàn)代化（從飲片配伍到組分配伍）的實現(xiàn)卻可能要付出幾代人的努力。方劑關鍵科學問題（藥效物質(zhì)和作用原理兩個基本清楚；單味藥、有效組分、化學成分三個化學層次；整體、組織、細胞、分子四個藥理水平以及在此基礎上的配伍配比）的解決，是今后方劑研究的重點。參考文獻1.

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