實時定量RTPCR檢測急性早幼粒細胞白血病PMLRARa融合基因(1)

1、    實時定量RTPCR檢測急性早幼粒細胞白血病PMLRARa融合基因(1)    】 本研究旨在建立用實時定量RTPCR檢測急性早幼粒細胞白血?。ˋPL）PMLRARa mRNA的方法，探討APL PMLRARa融合基因表達水平與療效的關(guān)系。用RTPCR擴增培養(yǎng)的NB4細胞的PMLRARa融合基因，取1g NB4細胞的總cDNA進行10倍的梯度稀釋，作為標準品，建立熒光定量RTPCR方法，對方法的靈敏性、穩(wěn)定性、重復(fù)性進行了測定。定量檢測4例急性早幼粒細胞白血?。ˋPL）患者治療前后骨髓內(nèi)PMLRARa融合基因

2、轉(zhuǎn)錄本水平，并對1例經(jīng)治療完全緩解后又復(fù)發(fā)的患者PMLRARa轉(zhuǎn)錄本水平（拷貝數(shù)）進行動態(tài)監(jiān)測。結(jié)果表明：用本研究 建立的實時定量RTPCR方法可檢測出10-5 g NB4細胞cDNA中的PMLRARa融合基因，其重復(fù)性的CT值，管間、批間變異系數(shù)（CV）分別為2.1%、3.8%。4例患者初治骨髓PMLRARa基因轉(zhuǎn)錄本水平的分別為1 884、5 533、1 803、4 677拷貝，平均為3 475拷貝。經(jīng)ATRA 化療治療后其PMLRARa基因轉(zhuǎn)錄水平下降至40、135、79、229拷貝，平均為121拷貝。還有1例患者治療前PMLRARa基因轉(zhuǎn)錄本水平為8 600拷貝，經(jīng)過4個月治療，雖然此

3、時患者處于完全緩解期，但其轉(zhuǎn)錄水平拷貝數(shù)仍有730。3個月后患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)錄本水平升至為11 000拷貝。經(jīng)過ATRA 化療治療后轉(zhuǎn)錄本水平又逐漸下降至1 200拷貝。結(jié)論；建立的實時定量RTPCR靈敏、重復(fù)性好。治療后APL患者的PMLRARa融合基因轉(zhuǎn)錄本水平明顯下降，復(fù)發(fā)時基因轉(zhuǎn)錄本水平又升高。融合基因表達水平的改變與臨床疾病進展關(guān)系一致，這有助于監(jiān)測白血病微小殘留病，評價療效及判斷預(yù)后。 【關(guān)鍵詞】 急性早幼粒細胞白血病    Detection of PML/RARa Transcripts in Acute Promyelocytic Le

4、ukemia by Realtime Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction    Abstract    Tihs study was purposed to establish a realtime quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) for detection of PML/RARa fusion gene in patient

5、s with acute promyelocytic leukemia (APL) and to explore the relationship between the expression level of PML/RARa fusion gene transcript and the clinical status or efficacy of the therapy in APL. The conventional RTPCR was used to amplify PML/RARa gene from cultured NB4 cells. Standard cu

6、rves were constructed by modified realtime PCR on standard template after 10fold serial dilutions of cDNA of 1 g NB4 cells. The sensitivity, stability and repeatability of this method was determined. The PML/RARa gene transcripts of bone marrows in 4 APL patients before and after treatment and in 1

7、APL patient relapsed after complete remission were dynamically detected by modified realtime quantitative RTPCR. The results indicated that the sensitivity of realtime quantitative RTPCR for detecting PML/RARa fusion gene was about 10-5 g cDNA from NB4 cells, the repeatability and reproducibility of

8、 this method were satisfactory, intraand interassay coefficients of variation were 2.1% and 3.8%. The copy numbers of PML/RARa transcripte reflecting PML/RARa fusion gene expression level in 4 newly diagnosed patients with APL were 1884, 5533,1803, 4677 and the median was 3 475. After ATRA chemother

9、apy copy numbers of PML/RARa transcript decreased to 40, 135, 79, 29, and mean was 121. Another patients PML/RARa gene copy number was 8600 at diagnosis, the gene copy number was 730 after therapy for 4 months, although he was in complete remission, but copy number increased to 11 000 when APL relap

10、sed 3 months later.The copy number efficiently reduced to 1200 after ATRA chemotherapy.It is concluded that the established realtime quantitative RTPCR method is sensitive, reliable, accurate and repeatable. The efficiency of method was finally tested for patient samples, showing a PML/RARa transcri

11、pt copy number in APL patients significantly decrease after therapy, and increase at the time of relapse which indicate that changes of fusion gene expression levels coincide with clinical progress of disease. This method can be used to detect the minimal residual disease, assess response to treatme

12、nt and evaluate prognosis of disease.    Key words    realtime quantitative RTPCR; acute promyelocytic leukemia; PMLRARa fusion gene; minimal residual disease    實時定量RTPCR檢測急性早幼粒細胞白血病PMLRARa融合基因    急性早幼粒細胞白血?。ˋPL）具有特異性的染

13、色體易位t（15;17）易位，使17號染色體上的RARa基因與15號染色體上PML基因融合，產(chǎn)生融合基因PMLRARa。 實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）技術(shù)實現(xiàn)了從定性到定量的飛躍，自動化程度高，因而其應(yīng)用也越來越廣泛。我們應(yīng)用這一方法檢測PMLRARa融合基因作為APL臨床診斷、評估微小殘留?。∕RD）和判斷其預(yù)后的手段。 材料和方法    主儀器    PE9600型定性PCR擴增儀（美國PerkinElmer公司產(chǎn)品），PowerPac3000型電泳儀，Gel Doc1000紫外圖像分析系統(tǒng)和配套分

14、析軟件（BioRad公司產(chǎn)品），Gene Amp5700 Sequence Detecor定量PCR擴增儀及配套分析系統(tǒng)和配套分析軟件（美國BioRad公司產(chǎn)品）；5700型定量PCR儀（美國ABI公司產(chǎn)品）；5417R高速冷凍離心機和5415C高速離心機（德國Eppendorf公司產(chǎn)品）。    主試劑    RPIM 1640（Gibco公司產(chǎn)品）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品）；淋巴細胞分離液（中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)生物研究所產(chǎn)品）；TRIzoL試劑（美國MRC公司產(chǎn)品）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermenta

15、s公司產(chǎn)品）；PMLRARa基因、肌動蛋白(actin)寡核苷酸引物（上海生工生物工程公司產(chǎn)品）；DEPC水（焦碳酸二乙酯）(Bio Basic Inc產(chǎn)品)；LoadingBuffer, DNA Marker DL2000,Taq DNA聚合酶, dNTP(大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品)；Sybr Green染料(美國BioRad公司產(chǎn)品)。            作者：段連寧 郎麗 李惠民 劉華 王義民 張學(xué)美【摘】本研究旨在建立用實時定量RTPCR檢測急性早幼粒細胞白血&

16、#160;        本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。    檢測標本    細胞系 NB4細胞（引自上海瑞金醫(yī)院血液研究所）常規(guī)培養(yǎng)。    骨髓標本 取自5例APL患者的骨髓（男3例，女2例，14歲-42歲，平均年齡30歲）。  

17、;  單個核細胞的分離及總RNA提取    取患者EDTA抗凝骨髓2 ml，用淋巴細胞分離液分離獲得單個核細胞，然后對單個核細胞和培養(yǎng)的5×106個NB4細胞，分別采用TRIzoL試劑并按試劑操作說明書提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計測定濃度后，-80保存?zhèn)溆谩?#160;   引物的設(shè)計和合成    PMLRARa融合基因形成過程中，RARa上的斷裂點總是位于第2個內(nèi)含子內(nèi)，但是PML上的斷裂點存在很多變異，主集中在3個斷裂點叢集區(qū)（bcr）。bcr1在第

18、6個內(nèi)含子內(nèi)，形成長型轉(zhuǎn)錄本（L）。斷裂點bcr3在PML第3個內(nèi)含子內(nèi)，產(chǎn)生短型轉(zhuǎn)錄本（S）；而bcr2斷裂點位于第6外顯子內(nèi)形成變異型轉(zhuǎn)錄本（V）。這3種轉(zhuǎn)錄本分別占70（L），20（S）和10（V）。我們檢測了L型融合基因拷貝數(shù)。L型引物序列參照了國外文獻1，應(yīng)用actin作為內(nèi)對照，具體序列如下表：    L型 上游引物P6 ：5 GTCTTCCTGCCCAACAGC AACC3 (190 bp)；下游引物R1：5 CTCACAGGC GCTGACCCCATAGT3。actin 上游引物： 5 AACGGC TCCGGCATGTGCAA3 (11

19、7 bp)，下游引物： 5 CTTCTGACCCATGCCCACCA3    cDNA合成    取1 g總RNA，采用cDNA合成試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，20 l體系的組成如下：隨機引物（oligodT 0.5 g/l）1 l, 5×buffer 4 l, RNA酶抑制劑（20 U/l） 1 l, 10 mmol/L dNTP Mix 2 l, 逆轉(zhuǎn)錄酶（MMULV） 1 l。反應(yīng)條件37 5分鐘,42 60分鐘,70 10分鐘。cDNA合成后以cDNA為模板進行actin管家基因的PCR擴增(圖1)，判

20、斷是否逆轉(zhuǎn)錄成功。Figure 1. Electrophoresis pattern of actin amplified by RTPCR on agarose gel.    轉(zhuǎn)錄本類型的定性PCR確定    取上述cDNA 2 l作為模板，以L型的正反向引物進行PCR反應(yīng)。25 l體系包括10×buffer 2.5 l，MgCl2 (25 mmol/L)2.5 l，dNTP (10 mmol/L)1 l,Taq酶（5 U/l）0.2 l,正反相引物均為1 l。反應(yīng)條件：94 5分鐘，94 45秒，6

21、0 60秒，72 90秒，共40個循環(huán)，72 6分鐘。    L型轉(zhuǎn)錄本的擴增長度190 bp。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如圖2：退火溫度為58時在250-500 bp之間有非特異性條帶，60時非特異性條帶較58時少，我們選擇60為退火溫度。    Figure 2. Electrophoresis pattern of PMLRARa amplified by RTPCR on agarose gel.     L型PMLRARa基因標準品的構(gòu)建  

22、0; 用紫外分光光度計測NB4細胞的cDNA的濃度后，取1 g的cDNA依次進行10倍的梯度稀釋，分裝為1 g，10-1 g，10-2 g，10-3 g，10-4 g，10-5 g作為各自的標準品。（在NB4細胞中1 g的cDNA包含104拷貝的PMLRARa基因1）（圖3）。    Figure 3. Amplification curves of reference at 102 -104 initiation copy number.    定量PCR反應(yīng)   

23、0;定量PCR反應(yīng)體系 25 l體系中包括 10×Buffer 2.5 l，MgCl2 (25 mmol/L)2.5 l，dNTP(10 mmol/L)1 l,Taq酶（5 U/l）0.2 l,正反相引物均為1 l, cDNA或標準品2 l，SYBERGREE染料3 l。        熔解曲線分析    先按94 5分鐘，94 45秒，60 60秒，72 90秒， 40個循環(huán)，72 6分鐘的反應(yīng)條件進行定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動進行了熔解曲線分析，如圖4

24、示：從熔解曲線圖中可見到兩個峰，一個峰值在69左右，另一個峰值在88左右。69左右的峰為引物二聚體小片段和染料結(jié)合釋放熒光產(chǎn)生的。88左右的峰為目的片段和染料結(jié)合釋放熒光產(chǎn)生的。我們?yōu)榱讼∑畏翘禺惍a(chǎn)物的影響，在延伸后加了升溫至87，持續(xù)5秒的步驟。則定量PCR反應(yīng)條件為：94 5分鐘，94 45秒，60 60秒，72 90秒，87 5秒，共40個循環(huán)，72 6分鐘。    Figure 4. Analysis of melting curve. Derivative(dF/Dt):negative value of ten to one time

25、derivative of fluorescence strength changed with temperature. 制作標準曲線    將各個標準品的起始拷貝數(shù)取對數(shù)，作為橫坐標，其所對應(yīng)的Ct值(循環(huán)域值，cycle threshold )作為縱坐標，即可做出相應(yīng)的標準曲線(圖5、6)。將各個樣本的平均Ct值，代入相應(yīng)的標準曲線，就可求出PMLRARa基因和actin的拷貝數(shù)。校正的PMLRARa轉(zhuǎn)錄本水平(Dose N)=（PMLRARa的拷貝數(shù)actin的拷貝數(shù)）×1052。結(jié)    果&#

26、160;   方法的靈敏度    對培養(yǎng)的 1 g NB4細胞的cDNA，進行10倍梯度稀釋，分別用建立的熒光定量RTPCR作檢測，可得到Ct值，其檢測PMLRARa融合基因的靈敏度達10-5 g cDNA（表1），由此制作出標準曲線的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.997。    方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性    我們對104基因拷貝數(shù)的模板分別做5個反應(yīng)管檢測。比較同一次反應(yīng)不同反應(yīng)管間的批內(nèi)變異及重復(fù)5次檢測比較不同時間的反應(yīng)結(jié)果的批間變異。檢測到該濃度同

27、一次反應(yīng)不同反應(yīng)管的Ct值分別為：21.8，21.5，20.8，21.4，22.0；不同時間檢測的Ct值為：20.8，21.6，22.3，23.0，21.7。批內(nèi)變異系數(shù)為2.1，批間變異系數(shù)為3.8%。這說明本方法穩(wěn)定性和重復(fù)性均好。    分析4例APL患者（經(jīng)定性PCR電泳結(jié)果確定為L型）初治時骨髓PMLRARa基因轉(zhuǎn)錄本水平，其轉(zhuǎn)錄本水平（拷貝數(shù)）分別為1 884，5 533，1 803，4 677，平均拷貝數(shù)為3475（表2）。    以上4例APL患者經(jīng)ATRA化療治療6個月左右后，再次檢測其PMLRA

28、Ra基因轉(zhuǎn)錄水平（拷貝數(shù)），結(jié)果分別為40，135，79，229，平均拷貝數(shù)為121。具體數(shù)據(jù)如表2。4例患者治療后基因拷貝數(shù)分別為治療前的了1/47，1/41，1/23，1/21。    治療前后患者PMLRARa轉(zhuǎn)錄本水平的比較    4 例患者治療前轉(zhuǎn)錄本水平的平均數(shù)3 475（1 803-5 533）拷貝， 經(jīng)ATRA化療治療 6 個月后再次檢測轉(zhuǎn)錄本水平，其平均數(shù)為121（40-229）拷貝。治療前和治療后轉(zhuǎn)錄本水平經(jīng)t檢驗得p=0.036(<0.05），說明治療前和治療后轉(zhuǎn)錄本水平之間差異有統(tǒng)計學(xué)

29、意義，其具體數(shù)據(jù)見表3。4例患者治療前轉(zhuǎn)錄水平的變異系數(shù)為55%,治療后轉(zhuǎn)錄水平的變異系數(shù)為68%,治療后變異系數(shù)大于治療前，由此推測不同患者對化療藥的敏感程度差異比較大。            作者：段連寧 郎麗 李惠民 劉華 王義民 張學(xué)美【摘】本研究旨在建立用實時定量RTPCR檢測急性早幼粒細胞白血         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文

30、版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。    還有1例患者治療前基因轉(zhuǎn)錄本水平為8 600拷貝，經(jīng)過4個月治療，雖然此時患者處于完全緩解期，但其轉(zhuǎn)錄水平拷貝數(shù)仍有730。3個月后患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)錄本水平升至為11 000拷貝。經(jīng)過ATRA 化療治療后轉(zhuǎn)錄本水平又逐漸下降至1 200拷貝（圖7）。    討    論    實時定量RTPCR（realtime qua

31、ntitative reversetranscription polymerase chain reaction, RTPCR）是在普通PCR反應(yīng)中加入能與PCR產(chǎn)物結(jié)合的熒光探針或熒光染料，使之熒光信號隨著擴增產(chǎn)物的增加而成比例增長，儀器實時檢測每一個循環(huán)結(jié)束后的熒光強度，通過與標準曲線對比得出定量結(jié)果?？梢灾苯訖z測目的基因的起始數(shù)量，從而動態(tài)監(jiān)測融合基因水平3。從擴增到產(chǎn)物分析都是閉管操作，最大限度避免了污染，無PCR后處理。SYBR green 是一種能與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料，游離時幾乎沒有熒光信號，本底很低。PCR進行過程中，它能結(jié)合到擴增產(chǎn)物雙鏈DNA的小溝中，熒光強度大大增強。

32、實驗中產(chǎn)生的非特異性雙鏈DNA（如引物二聚體）也會和染料結(jié)合產(chǎn)生熒光信號，其產(chǎn)生的干擾可通過熔解曲線分析得到解決。只有合適的引物就可實現(xiàn)目的基因的RQPCR4。較之序列特異性熒光探針，它無需探針設(shè)計，大大簡化了實驗難度，且價格便宜，是一種值得推薦的熒光定量PCR技術(shù)。國外文獻報道，用熒光定量PCR方法重復(fù)40次反應(yīng)，其Ct值的變異系數(shù)為1.6%。如電泳凝膠掃描定量，其變異系數(shù)高達31%，兩者相差19倍多4。本實驗管間、批間變異系數(shù)分別為2.1%和3.8%，與其相近。說明本方法穩(wěn)定性和重復(fù)性均好。我們使用定量RTPCR方法檢測PMLRARa融合基因的靈敏度達10-5 g cDNA，按10-5 g

33、 cDNA/細胞計算，本方法可從105個正常細胞中查出1個白血病細胞，與文獻報道的定量RTPCR方法相仿5。我們建立實時定量RTPCR檢測急性早幼粒細胞白血病融合基因，同時檢測同一標本的融合基因及管家基因，不必考慮RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄過程中的差異，以校正拷貝數(shù)（PMLRARa的拷貝數(shù)actin的拷貝數(shù)）×105表示，使用管家基因actin對結(jié)果進行標化，更具科學(xué)性。    應(yīng)用實時定量RTPCR技術(shù)，不僅能夠確定患者PMLRARa轉(zhuǎn)錄本的有無，而且可確定其轉(zhuǎn)錄本水平，觀察其動態(tài)變化。通過實時定量RTPCR監(jiān)測PMLRARa轉(zhuǎn)錄本水平的變化，可以預(yù)

34、測急性早幼粒細胞白血病患者的治療反應(yīng)，定量白血病細胞的殘余數(shù)量和預(yù)測復(fù)發(fā)，這比細胞遺傳學(xué)檢查早數(shù)月6,7。我們檢測了4例APL患者初治時骨髓PMLRARa基因轉(zhuǎn)錄本水平，其分別為1 884，5 533，1 803，4 677拷貝，平均拷貝數(shù)為3 475。經(jīng)ATRA化療治療后基因轉(zhuǎn)錄水平分別為40，135，79，229拷貝，平均拷貝數(shù)為121。經(jīng)治療后PMLRARa基因轉(zhuǎn)錄本水平明顯下降，證明治療是有效的。治療前和治療后轉(zhuǎn)錄本水平經(jīng)t檢驗得P=0.036<（0.05），這說明治療前和治療后轉(zhuǎn)錄本水平之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。4例患者治療前時轉(zhuǎn)錄水平的變異系數(shù)為55%,治療后轉(zhuǎn)錄水平的變異系數(shù)為

35、68%。治療后變異系數(shù)大于治療前，由此我們可以推測，不同患者對化療藥的敏感程度差異比較大。還有1例患者治療前PMLRARa基因轉(zhuǎn)錄本水平為8 600拷貝，經(jīng)過2個月誘導(dǎo)鞏固治療，雖然此時患者處于完全緩解期，但其轉(zhuǎn)錄水平拷貝數(shù)仍有730。5個月后患者復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)錄本水平升至11 000拷貝數(shù)。經(jīng)過ATRA 化療治療后轉(zhuǎn)錄本水平又逐漸下降至1 200。    總之，實時定量RTPCR是一種快速、準確和高度敏感的實驗方法，它不僅能夠檢測到微小殘留病灶的存在，更重的是，通過動態(tài)監(jiān)測PMLRARa轉(zhuǎn)錄本水平及其變化，可以預(yù)測急性早幼粒細胞白血病患者的治療反應(yīng)，定量白血

36、病細胞的殘余數(shù)量和預(yù)測復(fù)發(fā)，這比定性PCR檢測具有更為重的臨床意義。【參考文獻】1Cassinat B, Zassadowski F, Balitrand N, et al. Quantitation of minimal residual disease in acute promyelocytic leukemia patients with t(15;17) translocation using realtime RTPCR. Leukemia, 2000; 14:324-3282Gu BW，Hu J，Xu L，et alFeasibility and clinical significance