在乙肝病毒感染的HepG2細(xì)胞中對亞病毒纖維體的形態(tài)發(fā)生進(jìn)行的超微結(jié)構(gòu)分析_圖文

1、原文: Ultrastructural Analysis of Hepatitis B Virus in HepG2-TransfectedCells With Special Emphasis on Subviral Filament Morphogenesis作者: PHILIPPE ROINGEARD AND CAMILLE SUREAU作者單位: Laboratoire de Biologie Cellulaire, EP CNRS 117, Faculte´ de Me´decine de Tours,2 bis Boulevard Tonnelle´,

2、F-37032 Tours Cedex France.發(fā)表刊物: HEPATOLOGY Vol. 28, No. 4, 1998以下為中文翻譯稿:在乙肝病毒感染的HepG2細(xì)胞中對亞病毒纖維體的形態(tài)發(fā)生進(jìn)行的超微結(jié)構(gòu)分析摘要:空乙肝病毒(HBV的纖維狀顆粒在細(xì)胞內(nèi)的積累,會導(dǎo)致細(xì)胞的病變,即所謂的毛玻璃樣肝細(xì)胞。這次研究的目的是,在細(xì)胞水平上闡明這種纖維體的形成。通過電子顯微鏡,我們再次研究了產(chǎn)生乙肝病毒的HepG2T-14細(xì)胞,此細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的空的乙肝纖維體以及其它形成的乙肝病毒顆粒。通過觀察HepG2T14細(xì)胞的超薄切片,表明了在相當(dāng)大的細(xì)胞內(nèi)囊泡周圍,可能和前高爾基體有關(guān),產(chǎn)生了乙肝

3、病毒顆粒和纖維體。囊膜長的部分形成管狀的出芽,產(chǎn)生非常長的纖維體。這種現(xiàn)象和在乙肝慢性攜帶者的肝細(xì)胞中觀察到的相類似,在其中,感染的細(xì)胞不能通過細(xì)胞分泌途徑來外運長的乙肝纖維體,這似乎直接緣于細(xì)胞的病變效應(yīng)。前言:乙肝病毒(HBV是有包膜的嗜肝DNA病毒,在世界范圍內(nèi)它感染眾多的人群1。乙肝基因組包含在帶有病毒編碼的聚合酶的核衣殼之中,其外還帶有來自于宿主的脂膜成分,脂膜中含有三種病毒表面蛋白2。大(L蛋白,包含有preS1,preS2和S區(qū)域,它是從表面蛋白開放閱讀框的第一個啟起密碼處翻譯得來。中等(M蛋白,包含有preS2和S區(qū)域,以及小的(S蛋白,它們是從同框的較下游的啟始密碼處翻譯得來

4、,在合成過程中,所有三種蛋白共同翻譯,作為跨膜蛋白(它們彼此之間可以形成二硫鍵,它們被插入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中3。蛋白S跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜至少2次,形成了細(xì)胞質(zhì)環(huán)以及腔內(nèi)的部分4。蛋白M有著相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),帶有額外的N末端preS2結(jié)構(gòu)域,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中5。蛋白L能夠形成兩種不同的跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),允許N末端的preS結(jié)構(gòu)域暴露于腔體內(nèi)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的細(xì)胞質(zhì)一側(cè)6。后者的形式對于乙肝的形態(tài)發(fā)生有著重要的作用,它建立起了細(xì)胞質(zhì)核心顆粒,和蛋白L的特異的preS結(jié)構(gòu)域上的序列的蛋白之間的相互作用7,8。和其它病毒相比較,乙肝形態(tài)發(fā)生上的一個特別之處在于,它的表面蛋白不僅包膜核衣殼而形成成熟的病毒粒子,而且在缺少核衣殼的條

5、件下,它還會形成球狀或纖維狀的空的亞病毒顆粒2。盡管包膜化的所有乙肝病毒顆粒包含有蛋白M和S,但纖維體和病毒粒子包膜卻富含蛋白L2。在形態(tài)發(fā)生過程中,在缺少其它任何別的病毒蛋白的情況下,蛋白M和S能夠出芽進(jìn)post-ER/pre-Golgi 體中,形成20nm的球形顆粒,然后通過分泌途徑被釋放出去9。相比較,蛋白L不能夠通過自身而分泌出去,只有當(dāng)和其它表面蛋白共表達(dá)時才可能完成分泌。這種顆粒的形態(tài)和分泌的效率依靠相關(guān)的其它表面蛋白的數(shù)量。少量的蛋白L導(dǎo)致產(chǎn)生可分泌的球狀的乙肝亞病毒顆粒,然而大量的蛋白L將產(chǎn)生不能有效分泌的纖維體10。盡管用突變的乙肝DNA轉(zhuǎn)染HuH7和HepG2細(xì)胞的乙肝形態(tài)

6、發(fā)生被廣泛地研究,但在細(xì)胞水平的乙肝病毒顆粒的形態(tài)發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)研究還沒有被充分闡明。特別的,長的L蛋白富集的纖維體顆粒的形態(tài)發(fā)生過程任是一個謎。在此次研究中,我們通過在多年前發(fā)展的HepG2-14細(xì)胞中的乙肝復(fù)制實驗11,12,進(jìn)行了超微結(jié)構(gòu)的研究,特別關(guān)注了乙肝亞病毒包膜纖維體的形成。材料和方法:細(xì)胞,HepG2-T14細(xì)胞株如其它地方所描述的11,12。用克隆的乙肝DNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,產(chǎn)生乙肝病毒顆粒11,此顆?？梢愿腥竞谛尚?3,由此來篩選細(xì)胞株。通過電鏡觀察,乙肝病毒顆粒和亞病毒包膜化的纖維體可以在細(xì)胞內(nèi)囊泡中發(fā)現(xiàn)12,相比較,用其它的感染產(chǎn)生乙肝病毒的細(xì)胞株,如HepG2-T

7、2.2.15,則觀察不到細(xì)胞內(nèi)的這種顆粒14,15。這是由于在HepG2-14細(xì)胞中可以高水平表達(dá)蛋白L的結(jié)果,如可以通過強(qiáng)的免疫細(xì)胞化學(xué)方法對這些細(xì)胞中的preS1抗原進(jìn)行檢測12。HepG2-T14細(xì)胞株和HepG2親本細(xì)胞株一樣,在37的CO2條件下,RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),并加入濃度為20%的滅活胎牛血清(Gibico, 100U/mL的親霉素和100mg/mL的鏈霉素。上清液的電鏡觀察收集細(xì)胞于細(xì)胞收集器中,5000轉(zhuǎn)4下離心1小時。澄清后的培養(yǎng)基加入到20%的蔗糖溶液中,其中含有150mmol/L的NaCl和20mmol/L的Tris鹽酸,PH值為7.4(TNE,用SW27轉(zhuǎn)

8、頭(Beckman, Somerset, NJ,25000轉(zhuǎn)4下離心16小時。沉淀重懸于TNE中,進(jìn)行梯度氯化銫離心,TNE中的wt/vol為20%到50%,用SW41轉(zhuǎn)頭(Beckman,35000轉(zhuǎn),4下離心16小時。從管子的底部收集離心樣品,并測定其密度。密度在1.20和1.24g/cm3的部分被收集并進(jìn)行透析。此處理后的樣品加于鍍碳的銅網(wǎng)上放置1分鐘。銅網(wǎng)用2%的醋酸鈾進(jìn)行負(fù)染1分鐘,完全干燥后,銅網(wǎng)在Jeol 1010XC電鏡下觀察(Tokyo, Japan。細(xì)胞水平的電鏡觀察,HepG2-T14細(xì)胞直截用HepG2細(xì)胞作為對照進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)分析。細(xì)胞用胰酶消化,收集,用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸緩沖

9、液沖洗,在含有4%的多聚甲醛,1%的戊二醛的0.1mol/L的磷酸緩沖液(PH 值7.2中進(jìn)行固定,放置48小時。之后,細(xì)胞用磷酸緩沖液沖洗,收集,用1%的四氧化鋨固定1小時。進(jìn)行梯度丙酮脫水后,細(xì)胞被包埋于環(huán)氧樹脂中,在60下聚合反應(yīng)24小時。用Reichert 超薄切片機(jī)(Heidelberg, Germang制做超薄切片,收集切片于銅網(wǎng)上,用1%的醋酸鈾和1%的檸檬酸鉛進(jìn)行染色。一百個HepG2-T14細(xì)胞樣品和二十五個HepG2細(xì)胞樣品(每個樣品包含大約100到200個細(xì)胞部分用Jeol 1010XC電鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果:通過負(fù)染對HepG2-T14細(xì)胞的上清進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其中含有三種類

10、型的乙肝病毒顆粒,包括完整的病毒粒子,球狀的亞病毒包膜顆粒和纖維狀顆粒(圖1。然而,更廣泛和精確的研究表明了一種乙肝病毒顆粒不同尋常的現(xiàn)象,即在一個包膜中有多于一個的核衣殼(圖1A,E和F。圖1,HepG2-T14細(xì)胞培養(yǎng)基中的乙肝病毒粒子和亞病毒顆粒的負(fù)染觀察。 標(biāo)尺F=100nm,如其它地方。A、E和F中的表示在同一包膜中包裝進(jìn)多個核衣殼。HepG2-T14細(xì)胞的超薄切片觀察發(fā)現(xiàn),有大概和post-ER/pre-Golgi體相關(guān)的相當(dāng)膨脹的囊泡出現(xiàn),因為其總表現(xiàn)為光滑的小泡體。這種大的囊泡,直徑可以達(dá)到5µm以上,這種現(xiàn)象在HepG2親本細(xì)胞系中從未觀察到。這些大的、膨脹的囊泡包

11、含有乙肝病毒粒子和亞病毒包膜纖維體,和用負(fù)染在培養(yǎng)基中觀察到的顆粒形態(tài)類似(圖112。然而,更廣泛的,使用多于10,000個HepG2-T14細(xì)胞進(jìn)行的觀察發(fā)現(xiàn)了一些新的信息,這可以解釋在這些囊泡周圍這種亞病毒包膜纖維體是如何形成的。圖2和圖3顯示了在2個不同的HepG2-T14細(xì)胞中的2個非常大的囊泡,在其中,長的亞病毒纖維和一些病毒粒子發(fā)現(xiàn)于這些囊泡的周圍。這表明,核衣殼顆粒出芽進(jìn)乙肝的包膜蛋白(包含有囊泡的膜,這個機(jī)制大概即完整的乙肝病毒顆粒的形態(tài)發(fā)生過程。更重要的是,這些觀察表明,在這些膨脹的細(xì)胞內(nèi)囊膜上進(jìn)行的管狀出芽,形成了這種長的亞病毒包膜纖維體。這個特征也在圖4中觀察到,其在四個

12、不同的HepG2-T14細(xì)胞中存在有不同的囊泡,它們有著特別多的長的纖維體。圖2,HepG2-T14細(xì)胞的超薄切片,在大的囊泡中存在乙肝 病毒粒子和亞病毒包膜纖維體。A中的示尺為1µm,B,C和D中的為100nm。A表示為低放大倍數(shù)下(大的白色箭頭直徑大于5µm的囊泡。B和D表示在高的放大倍數(shù)下對同一個囊泡的觀察,囊泡膜上以管狀出芽的方式形成亞病毒包膜纖維體。C表示在高的放大倍數(shù)下對囊泡腔體的觀察,清楚地表明乙肝病毒粒子的核衣殼由一個包膜所包裹。A中的箭頭表示在B、C和D中的放大部分。圖3,HepG2-T14細(xì)胞囊泡中的乙肝病毒粒子和纖維體的形態(tài) 發(fā)生。A中的標(biāo)尺為1

13、81;m,B和C的為100nm,在低的放大倍數(shù)下,A中的囊泡的箭頭表示為在高的放大倍數(shù)下,B和C的部分。A中表現(xiàn)了通過管狀出芽(在B中放大,亞病毒包膜纖維體出現(xiàn)在囊泡腔體中,以及病毒粒子在囊泡膜的出芽(在C中放大。 圖4,在四個不同的HepG2-T14細(xì)胞中,長的亞病毒包膜纖維體的形態(tài)發(fā)生和在囊泡中的積累。D中的標(biāo)尺為100nm,如其它地方。討論:乙肝病毒包膜蛋白L的表達(dá),導(dǎo)致了亞病毒包膜纖維體的形成,并且它和乙肝包膜蛋白一起滯留在細(xì)胞內(nèi)的空間中10。蛋白L的這種滯留的機(jī)制還沒有完全被闡明。先前的研究建立在用突變的乙肝蛋白L的細(xì)胞轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上,揭示了蛋白L由于和細(xì)胞質(zhì)因子相互作用而作為一種跨膜

14、蛋白停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。最近的研究表明,單獨的蛋白L可以在細(xì)胞內(nèi)形成20nm的球形顆粒,這和蛋白S和M形成的顆粒類似,但是它通過鈣聯(lián)蛋白停留在細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)17。然而,所謂的慢性乙肝感染的毛玻璃樣肝細(xì)胞的形成似乎是由在細(xì)胞內(nèi)積累的大量蛋白L纖維體所引起的。這種細(xì)胞內(nèi)積累已經(jīng)在病人的慢性乙肝感染的晚期中被觀察到,特別是在肝硬化期間,當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)乙肝的表面蛋白,與之相聯(lián)系的是低水平的乙肝表面蛋白免疫血清18,19。轉(zhuǎn)基因小鼠的肝細(xì)胞帶有這種蛋白L的積累滯留,則會發(fā)展為細(xì)胞的損傷作用20,它會誘導(dǎo)肝的再生,在這個模型中最終導(dǎo)致肝癌21。電鏡觀察這種來自于小鼠的過量表達(dá)蛋白L的肝的切片,發(fā)現(xiàn)了大約

15、直徑為20nm的亞病毒包膜纖維體,并且甚至可以延伸至800nm,它們積累于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中20。蛋白L的滯留也被發(fā)現(xiàn)和一種獨特的綜合癥,即纖維淤膽性肝炎(FCH,相聯(lián)系,它的特征為肝細(xì)胞的氣球運動和有著顯著的膽汁阻塞,但是它一般只有很少的炎癥發(fā)生,它發(fā)生于免疫抑制的乙肝攜帶者22,23。來自于發(fā)生了FCH的病人的肝臟樣品,通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中有著同樣的乙肝亞病毒包膜纖維體的積累24。盡管這些對過量表達(dá)蛋白L的轉(zhuǎn)基因小鼠和FCH病人的肝細(xì)胞進(jìn)行電鏡觀察,得到了很多關(guān)于乙肝纖維體的信息20,24,但一個近來的研究表明,在HuH7細(xì)胞中過量表達(dá)蛋白L能夠產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)球狀的顆粒而非形成纖維體17。作

16、者不排除以下猜測,即在HuH7細(xì)胞中缺少亞病毒纖維體形成所需的細(xì)胞因子。然而,他們指出這樣一種纖維狀顆粒大概在相同的位置上通過積累和融合進(jìn)許多球狀顆粒17,我們的觀察卻表明,這種長的亞病毒包膜纖維通過管狀出芽于囊膜上而形成,此囊泡處乙肝包膜蛋白已經(jīng)積累了。這種在兩個觀察上發(fā)生的不一致現(xiàn)象,可能是由于兩個研究中使用了不同的細(xì)胞系統(tǒng)。Xu17等人使用的是HuH7細(xì)胞,是通過瞬時轉(zhuǎn)染,并且在轉(zhuǎn)染一些天后進(jìn)行顆粒形成的檢測,然而,我們使用的是HepG2-T14細(xì)胞,它可以穩(wěn)定產(chǎn)生乙肝病毒。因為這些細(xì)胞可以長期產(chǎn)生乙肝病毒,顆粒積累處的囊泡大小會隨著時間而增加,這種現(xiàn)象對于亞病毒包膜纖維體的形成是至關(guān)重

17、要的。這種增大的囊泡在HuH7細(xì)胞中沒有觀察到,但僅在轉(zhuǎn)基因小鼠的肝細(xì)胞20或FCH病人的肝細(xì)胞24中表現(xiàn)出亞病毒包膜纖維體累的現(xiàn)象。對HepG2-T14細(xì)胞釋放到培養(yǎng)基中的乙肝病毒顆粒的檢測表明,存在一種包含有核衣殼的纖維體,它是由同一個包膜包裹進(jìn)2個或3個核衣殼顆粒。這種產(chǎn)生畸變的顆粒的意義還不清楚,因為在自然的乙肝攜帶者中還未發(fā)現(xiàn)有如此的顆粒。然而,這種類型的顆粒大概在體內(nèi)或體外都缺少穩(wěn)定性。盡管我們不能排除它們通過和乙肝病毒粒子的融合,而形成于HepG2-T14細(xì)胞的膜腔中,我們指出,這種畸變的顆粒也通過管狀出芽形成于囊泡膜外,此處存在核衣殼,并且附近有著大量的蛋白L。這也表明了包裝進(jìn)

18、包膜蛋白的事實,核衣殼需要存在蛋白L并且通過蛋白L的preS區(qū)域發(fā)生特異性的蛋白與蛋白間的相互作用7,8。如同在轉(zhuǎn)基因小鼠模型20中的一樣,我們在HepG2-T14細(xì)胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了較那些存在于細(xì)胞內(nèi)的纖維體要短的形式。這可能表明,長的纖維體不能有效地通過細(xì)胞分泌途徑運輸,導(dǎo)致了它們在細(xì)胞內(nèi)囊泡中的積累。其它的這種滯留的機(jī)制是,存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶蛋白的活性,但纖維體的大小似乎是分泌的限制因素,而非細(xì)胞內(nèi)滯留的結(jié)果。總之,我們的研究在細(xì)胞內(nèi)水平對乙肝相關(guān)的包膜纖維體的形態(tài)發(fā)生有了新的發(fā)現(xiàn)。乙肝亞病毒顆粒的纖維狀形態(tài)的發(fā)生似乎是來自于大的,膨脹的囊泡,此囊泡通過管狀出芽來形成纖維體。相當(dāng)長的纖

19、維體將滯留在囊泡中。因為包膜纖維體在細(xì)胞內(nèi)的積累直接和乙肝攜帶者的肝細(xì)胞的損傷有關(guān),我們的研究也許對設(shè)計出此類抗病毒藥物有借鑒借值,即特異性地阻止長的纖維體的形成。參考文獻(xiàn):1. Lee WM. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 1997;337:1733-1745.2. Ganem D. Hepadnaviridae and their replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, eds. Fields Virology, 3rd ed. Philadelphia: Raven,1996:

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