枯草芽孢桿菌B11基因文庫的構(gòu)建及與拮抗物質(zhì)的生物合成相關(guān)基因的克隆_圖文

1、文章編號 :1008-3464(2007 01-0008-06枯草芽孢桿菌 B 11基因文庫的構(gòu)建及與拮抗物質(zhì)的生物合成相關(guān)基因的克隆吳雪 1, 2, 段承杰 1, 2, 黎起秦 3, 蒙顯英 3, 林緯 3, 馮家勛 1, 2(廣西大學(xué) 1廣西亞熱帶生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實驗室 ; 2生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 ; 3農(nóng)學(xué)院 , 廣西 南寧 530005摘要 :枯草芽孢桿菌菌株 B 11對廣泛的植物病原真菌和細(xì)菌都具有拮抗作用 。以柯斯質(zhì)粒 pW EB TN C為載體構(gòu)建了枯草芽孢桿菌菌株 B 11的基因文庫 , 文庫含 9000個克隆 。 文庫克隆中插入的 DNA 片段平均為 4211kb , 該文

2、庫含有菌株 B 11基因組中任一基因的概率為 99199%。采用平板活性檢測法篩選文庫 , 篩選到 1個對茄青枯假單胞菌菌株 P 13具有拮抗活性的文庫克隆 GXN 9527, 該克隆的重組質(zhì)粒 pGXN 9527含有 50kb 的菌株 B 11的 DNA 。 文庫克隆對革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌如水稻黃單胞菌水稻變種也具有拮抗活性 , 而對革 蘭氏陽性細(xì)菌如地衣芽孢桿菌和植物病原真菌如尖孢鐮刀菌西瓜?；?、 立枯絲核菌 、 有拮抗活性 。 分別含有 pGXN 9527的 18、 12、 9、 8kb B am H 片段的亞克隆對 P 13, 說明 編碼該拮抗物質(zhì)的生物合成基因很可能成簇存在 。

3、關(guān)鍵詞 :枯草芽孢桿菌 ; 基因文庫 ; 拮抗中圖分類號 :Q 78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 :ACon subtilis stra i n B 11and clon i ngb iosyn thesis of an tagon istic substanceW U Xue 1, 2, DU AN Cheng 2jie 1, 2, L IQ i 2qin 3,M EN G X ian 2ying 3, L I N W ei 3, FEN G J ia 2xun1, 2(1 Guangxi Key L abo rato ry of Subtrop ical B i o resources Conservat

4、i on and U tilizati on ;2 Co llege of L ife Science and Techno logy ; 3 Co llege of A griculture , GuangxiU niversity , N anning 530005, China Abstract :B acillus subtilis strain B 11disp layed an tagon istic activity again st a w ide variety of p lan t p athogen ic fungi and bacteria . A genom ic l

5、ib rary of the strain B 11con tain ing 9000clones w as con structed . T he average size of the in serted DNA in recom b inan t p las m ids w as 4211kb and the p robab ility of harbo ring any gene in the genom e of the strain B 11w as 99199%.T he lib rary w as screened fo r an tagon istic activity ag

6、ain st R a lston ia solanacea rum strain P 13and a clone carrying a 50kb in serted DNA w as iso lated , w h ich w as designated as GXN 95271P late assay show ed that the GXN 9527cou ld inh ib it the grow th of p lan t p athogen ic Gram 2negative bacterium X an tho m onas ory z ae p v . ory z ae , bu

7、 t no t inh ib it the Gram 2po sitive bacterium B acillus lichen if or m is o r the p hytop athogen ic fungi F usa rium oxy sp orum f . sp . n iveum , and R h iz octon ia solan i . T he subclone con tain ing an individual 18kb 、 12kb 、 9kb o r 8kb B am H fragm en t of p GXN 9527did no t exh ib it an

8、 tagon istic activity again st 第 26卷 第 1期 V o l 126, N o. 1廣 西 農(nóng) 業(yè) 生 物 科 學(xué) Jou rnal of Guangx i A gric . and B i o l . Science 2007年 3月 M ar . , 2007收稿日期 :2006-05-19; 修回日期 :2006-06-01。基金項目 :國家自然科學(xué)基金項目 (30260003 。作者簡介 :吳雪 (1980- , 女 , 廣西柳州人 , 碩士 , 現(xiàn)在廣西產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院工作 ; E 2m ail :m aom ao snow 8281261com

9、。通訊作者 :馮家勛 , 研究員 , 博士生導(dǎo)師 ; E 2m ail :feng pub lic 1nn 1gx 1cn 。strain P 13, indicating that genes invo lved in b i o syn thesis of an tagon istic sub stance (s m igh t be clu stered .Key words :B acillus subtilis ; genom ic lib rary ; an tagon is m枯草芽孢桿菌 (B acillus subtilis 是一類能夠形成具有較強(qiáng)抗逆性芽孢的革蘭氏陽性根際細(xì)

10、菌。 自 1945年 John son 等報道枯草芽孢桿菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)以來 , 人們從枯草芽孢桿菌的不同菌株中發(fā)現(xiàn)了 60多種結(jié)構(gòu)各異的抗生素 。這些抗菌物質(zhì)主要包括肽類抗生素和非肽類化合物 , 它們中的大多數(shù)分子 質(zhì)量較小 (介于 3003000D a 123。其中 sub tilin 、 ericin 、 m ersacidin 、 sub lancin 等肽類抗生素是通過 核糖體途徑合成的 , 而通過非核糖體途徑合成的肽類抗生素有 su rfactin 、 itu rin fam ily 、 fengycin 以及 bacilysin 等 ; 枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的非肽類化合物主要有聚酮類化

11、合物 difficidin 、多烯 bacillaene 、磷脂bacilysocin 以及氨基糖 3, 3 2N eo trebalo sadiam ine (N TD 等 。它們具有抑制真菌 、細(xì)菌 、病毒 、支原體等作用 , 具有較高的利用價值 1。已有的克隆枯草芽孢桿菌的抗生素生物合成基因的方法如下 :(1 根據(jù)已知抗生素生物合成基因 的保守序列設(shè)計探針 , 通過雜交的方法克隆同源的抗生素生物合成基因 4; (2 根據(jù)已知抗生素生物合 成基因的保守序列設(shè)計引物 , 通過 PCR 擴(kuò)增的方法克隆同源的抗生素生物合成基因 5; (3 用轉(zhuǎn)座子 突變的方法定位和克隆抗生素生物合成基因 6。

12、目前 , 素生物合成相關(guān)基因 。 如枯草芽孢桿菌菌株 A TCC 6633sp aB aC , sunT , bd b B 基因 8, 菌株 61884的 yw f H 基因 9, 菌株 A 1 3的 A TCC 6633的 38kb 的 m yco sub tilin 基因簇 1112等 。然而 , 通過構(gòu)建枯草 , 在國內(nèi)外文獻(xiàn)中未見報道 。(F usa rium oxy sp orum Sch l f . sp . n iveum 生 , 13, 14。其中 , 細(xì)菌菌 株 B 11, 其對西瓜枯萎病防治效果最好 13, 14, 對廣泛的植物病原真菌和病原 細(xì)菌都具有拮抗作用 , 被鑒定

13、為枯草芽孢桿菌 15。本工作構(gòu)建了枯草芽孢桿菌 B 11的基因文庫 , 通過 平板活性檢測法篩選文庫 , 得到一個對茄青枯假單孢菌菌株 P 13具有拮抗活性的文庫克隆 , 初步檢測 了該克隆產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)的抗菌譜 。1材料與方法111材料11111菌株枯草芽孢桿菌菌株 B 11分離自土壤 13; 植物病原真菌菌株為尖孢鐮刀菌西瓜?；途?株 WM 18、立枯絲核菌 (R h iz octon ia solan i 和水稻稻灰梨孢菌 (M ag nap orthe g risea , 細(xì)菌為茄青枯 假 單胞菌 (R a lston ia solanacea rum 菌株 P 13、 水稻黃單胞菌

14、水稻變種 (X an tho m onas ory z ae p v . ory z ae 菌株 13751和地衣芽孢桿菌 (B acillus lichen if or m is 菌株 GXN 151。11112培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件枯草芽孢桿菌 B 11用 YDC 培養(yǎng)基 (酵母粉 1010g , 蔗糖 2010g , 水 1L , pH 710 37°C 培養(yǎng) 12h ; 大腸桿菌用 LB 培養(yǎng)基 (胰蛋白胨 1010g , 酵母粉 510g , N aC l 510g , 水 1L , pH 710 37°C 培養(yǎng) 12h ; 植物病原真菌用 PDA 培養(yǎng)基 (馬鈴薯 2

15、00g , 蔗糖 20g , 瓊脂 15g , 水 1L 28°C 培養(yǎng) 4872h ; 茄青枯假單胞菌 P 13用 GBM 培養(yǎng)基 (聚蛋白胨 5g , 蔗糖 6g , 酵母粉 2g , 牛肉膏 2g , 瓊脂 8g , 水 1L , pH 710 32°C 培養(yǎng) 24h ; 水稻黃單胞菌水稻變種 13751用 OA 培養(yǎng)基 (蔗糖 10g , 胰蛋白 胨 5g , 聚蛋白胨 2g , 味精 1g , 甲硫氨酸 011g , K 2H PO 40172g , KH 2PO 40128g , N H 4C l 110g , M gC l 2 6H 2O 110g , 瓊脂

16、18g , 水 1L , pH 710 28°C 培養(yǎng) 48h 。11113主要的酶和試劑 限制性內(nèi)切酶 、 Ex T aq DNA 聚合酶及 T 4DNA 連接酶購自 T aKaR a 公司 ; 文庫構(gòu)建試劑盒 pW EB TN C TM Co s m id C lon ing K it 購自 Ep icen tre 公司 ; PCR 產(chǎn)物純化試劑盒 W izard PCR P rep s DNA Pu rificati on System K it 及 p GE M 2T easy 載體試劑盒購自 P rom ega 公司 ; 其他化學(xué)試 劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純 。9第 1期 吳

17、雪等 :枯草芽孢桿菌 B 11 基因文庫的構(gòu)建及與拮抗物質(zhì)的生物合成相關(guān)基因的克隆112方法11211 DNA 操作染色體 DNA 和質(zhì)粒 DNA 的提取 、 DNA 酶切 、 DNA 回收 、 DNA 的連接 、質(zhì)粒的 轉(zhuǎn)化等均按標(biāo)準(zhǔn)程序 16。11212基因文庫的構(gòu)建回收 4050kb 的基因組 DNA , 參照 Ep icen tre 公司 pW EB TN C TM Co s m id C lon ing K it 試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行 。11213基因文庫的篩選采用平板活性檢測法篩選基因文庫 。 將文庫克隆逐一挑取點(diǎn)接在涂布有茄青 枯假單胞菌 P 13的平板 (含 100g mL 氨

18、芐青霉素和 12g mL 氯霉素 , 37°C 培養(yǎng) 1216h 后 , 菌落 周圍有抑菌圈即為陽性克隆 。提取陽性克隆的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化 E scherich ia coli EP I 100, 檢測轉(zhuǎn)化子的拮 抗活性 。11214拮抗物質(zhì)的提取將陽性克隆接種于含有 100g mL 氨芐青霉素 的 LB 培養(yǎng)基 , 37°C 搖床培 養(yǎng)過夜 , 4°C 、 8000r m in 離心培養(yǎng)液 15m in , 收集上清液即為陽性克隆培養(yǎng)物的無細(xì)胞上清液 。 11215拮抗活性檢測用瓊脂平板擴(kuò)散法 17檢測拮抗物質(zhì)對茄青枯假單胞菌 P 13、 水稻黃單胞菌水稻 變種 1

19、3751、 地衣芽孢桿菌 GXN 151、 尖孢鐮刀菌西瓜?；?WM 18和水稻稻灰梨孢菌的拮抗活性 。用對峙法 17測定拮抗物質(zhì)對立枯絲核菌的拮抗活性 。2結(jié)果與分析211菌株 B 11 基因文庫的構(gòu)建圖 1枯草芽孢桿菌菌株 B 11基因文庫中重組質(zhì)粒的 B am H 酶切分析 F ig 11 Restr iction ana lysis of reco m bi nan t pla s m ids fro m the geno m iclibrary of B acillus subtilis stra i n B 11with B am H M 1. E co R ; M 2. 1kb

20、 DNA ladder ; 112. 用 B am H 酶切 的文庫克隆中的質(zhì)粒 DNA (R ecom b inan t p las m id DNA s digested w ith B am H from clones 以柯斯質(zhì)粒 pW EB TN C 為載體 , 構(gòu)建了枯草芽孢桿菌菌株 B 11的基因文庫 。 該文庫含有約 9000選取其中 12, H , , 外源 DNA (圖 1 , 這些外源 DNA 的酶切帶型都各不相同 , 說明該文庫隨機(jī)地克隆了外源 DNA 。 文庫克隆中插入的 DNA 最大為 6215kb , 最小為3216kb , 平均大小為 4211kb 。 已知枯草芽

21、孢桿菌菌株 168的全基因組長 4214810bp 18, 假定菌株 B 11與 168基 因組相類似 , 據(jù) C larke 2Carbon 公式 N =ln (1-P ln (1-f 19, 那么構(gòu) 建的基因文庫含有菌株 B 11基因組中 任一基因的概率為 99199%, 說明構(gòu)建 的文庫質(zhì)量符合要求 。212菌株 B 11基因文庫的篩選以茄青枯假單胞菌菌株 P 13為指示菌 , 在瓊脂平板上檢測該基因文庫的克隆對 P 13的拮抗活性 , 結(jié) 果篩選到 1個陽性克隆 。 提取該陽性克隆的質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌 , 獲得的轉(zhuǎn)化子對 P 13仍具有拮抗活 性 , 說明文庫克隆的重組質(zhì)粒確實含有編

22、碼拮抗物質(zhì)的基因 , 將該重組質(zhì)粒命名為 p GXN 9527。 限制性 內(nèi)切酶 B am H 酶切分析表明 , p GXN 9527含有 50kb 的外源 DNA (圖 2 , 包括 18、 12、 9、 8、 215kb 等 5個 B am H 片段 ?？寺?GXN 9527培養(yǎng)物的無細(xì)胞上清液在 P 13平板上出現(xiàn)抑菌圈 , 該上清液經(jīng)過 100°C 煮沸 10m in 處理后在 P 13平板上仍然可出現(xiàn)抑菌圈 (圖 3 。說明該文庫克隆產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)分 泌于細(xì)胞外 , 并且該拮抗物質(zhì)能夠耐受高溫 。01廣 西 農(nóng) 業(yè) 生 物 科 學(xué) 第 26 卷 213克隆 GXN 9527

23、 產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)的抗菌譜檢測結(jié)果表明 , GXN 9527假單胞菌 P 13菌株 (圖 42A 具有拮抗作用 , 而對于革蘭 菌株 (2(圖 42D 、立枯 絲核菌 (圖 42 18菌株 (圖 42F , 則沒有拮抗活性 。圖 4陽性克隆 GXN 9527的抗菌譜測定F ig 14 I nh ibitory spectru m test of the clone GXN 9527aga i n st plan t pa thogen sA 1茄青枯假單胞菌 (R a lston ia solanacea rum ; B 1水稻黃單胞菌 (X an tho m onas ory z ae pv

24、1ory z ae ;C 1地衣芽孢桿菌 (B acillus lichen if or m is ; D 1水稻稻灰梨孢菌 (M ag nap orthe g risea ;E 1立枯絲核菌 (R h iz octon ia solan i ; F 1尖孢鐮刀菌西瓜?；?(F usa rium oxy sp orum Sch l f 1sp 1n iveum 214菌株 B 11基因文庫中陽性克隆 GXN 9527的亞克隆為了進(jìn)一步確定產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的基因在 p GXN 9527中的具體位置 , 對 p GXN 9527進(jìn)行亞克隆 。根 據(jù) p GXN 9527的酶切圖譜 , 選擇最適合的限

25、制性內(nèi)切酶 B am H 完全消化 p GXN 9527, 回收 18、 12、 9和 8kb 4個 DNA 片段 , 分別與 p GE M 23Zf (+ 載體連接并轉(zhuǎn)化 E scherich ia coli EP I 100, 將重組質(zhì)粒 分別命名為 p GXN 952721、 p GXN 952722、 p GXN 952723、 p GXN 952724(圖 5 。檢測亞克隆對茄青枯假 單胞菌 P 13的拮抗活性 。 結(jié)果表明 , 它們的培養(yǎng)物的無細(xì)胞上清液對 P 13都不具有拮抗作用 。 3討論本工作以柯斯質(zhì)粒 pW EB TN C 為載體構(gòu)建了枯草芽孢桿菌菌株 B 11的基因文庫

26、, 以茄青枯假單 胞菌為指示菌株 , 通過平板活性檢測法從文庫中篩選到編碼拮抗物質(zhì)生物合成基因的克隆 GXN 9527。 該克隆產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)分泌于細(xì)胞外 , 并且對高溫具有一定的耐受性 。 拮抗譜檢測表明 , 該克隆對引 起農(nóng)業(yè)重要病害的革蘭氏陰性細(xì)菌如水稻黃單胞菌水稻變種也具有拮抗作用 , 而對革蘭氏陽性細(xì)菌如11第 1期 吳雪等 :枯草芽孢桿菌 B 11基因文庫的構(gòu)建及與拮抗物質(zhì)的生物合成相關(guān)基因的克隆 圖 5 GXN 9527的亞克隆質(zhì)粒的 B am H 酶切分析 F ig 15 Restr iction ana lysis of reco m bi nan t pla s m ids

27、 of the GXN 9527subclones with B am M 11 E co R ; M 2. 1kb DNA ladder ; 1H 酶切亞克 隆質(zhì)粒 952721, 3, pGXN 952724(R ecom b t p 2pGXN 952722, 3, 952724w ith B am H 地衣芽孢桿菌和植物病原真菌如尖孢鐮刀菌西瓜專化型 、 立枯絲核菌 、 水稻稻灰梨孢菌都沒有拮抗活性 。野生菌 B 11菌株具有較廣的抗菌譜 ,對廣泛的植物病原真菌和細(xì)菌如水稻黃單胞菌水稻變種 、 茄青枯假單胞菌 、 尖孢鐮刀菌西瓜專化型 、 立枯絲核菌 、 水稻稻灰梨孢菌均具有拮抗活性

28、15, 而文庫克隆GXN 9527只拮抗革蘭氏陰性細(xì)菌 , 二者的抗菌譜不一致 。 據(jù)此推測 , 枯草芽孢桿菌野生菌 B 11菌株能產(chǎn)生兩種或兩種以上的拮抗物質(zhì) , 本工作僅以革蘭氏陰性細(xì)菌P 13為指示菌 , 克隆到其中一種拮抗物質(zhì)的生物合成基因 , 該基因的表達(dá)產(chǎn)物對革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌具有拮抗活性 。 如果以革蘭氏陽性細(xì)菌或真菌為指示菌株篩 選菌株 B 11基因文庫 , 很可能從中進(jìn)一步 篩選到產(chǎn)生其他拮抗物質(zhì)的生物合成基 因 。文庫克隆 GXN 9527、 12、 9、 8kb B am H 外源片段的亞克隆 am H 酶切打斷了拮抗物質(zhì)生物合成基因或者生物合成途 , , GXN 9

29、527可能包括完整的生物合成途徑基因 (簇 , 該基 因 (簇 。參考文獻(xiàn) :1 ST E I N T . B acillus subtilis an tib i o tics :structu res , syn theses and specific functi on s J . M o lecu larM icrob i o logy ,2005, 56(4 :845-857.2 SON EN SH E I N A L , HOCH J A , LO S I CK R . B acillus subtilis and its clo sest relatives :F rom gene

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38、clon ing M . N ew Yo rk: Co ld Sp ring H a rbo r L abo ra to ry P ress , 2001. 體項目如下: 獲一等獎項目: 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院黃日波教授主持的“高密度培養(yǎng)生產(chǎn)高活力 乙酰 乳酸脫羧酶” 。 獲二等獎項目: ( 1 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院盧美英教授主持的 “促花、 控梢、 保果調(diào)控技術(shù)研究與應(yīng) 用” ( 2 廣西壯族自治區(qū)林業(yè)勘測設(shè)計院與廣西大學(xué)林學(xué)院合作完成的“廣西十萬大山自然保護(hù)區(qū)生 ; 物多樣性保護(hù)研究” ( 3 廣西樂土生物科技有限公司、 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院合作完成的 ; “0. 101% 芐丁藥肥顆粒劑研制與開發(fā)” ( 4 廣西壯族自治區(qū)建筑材料科學(xué)研究設(shè)計院與廣西大學(xué) ; 化學(xué)化工學(xué)院合作完成的 “研制水泥分散劑” 。 獲三等獎項目: ( 1 廣西大學(xué)物理科學(xué)與工程技術(shù)學(xué)院郭進(jìn)教授主持的 “貯氫合金元素間相互作 用與貯氫性能的相關(guān)性研究” ( 2 廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院陳小鵬教授主持的“松脂催化加氫反應(yīng)動力 ; 學(xué)及其氫化產(chǎn)物分離基礎(chǔ)理論的研究