水稻穎殼異常發(fā)育突變體Oseg1和Oseg2的基因圖位克隆及基因功能分析

1、單位代號(hào)：雌擘號(hào)邶，鉀上海大學(xué)碩士學(xué)位論文【蓄水稻穎殼異常發(fā)育突變體偽錨？和偽嘲的基因圖位克隆及基因功能分析作者王紅攙學(xué)科專業(yè)食品科學(xué)導(dǎo)師壅塞基煎絲韭大兵教授先成日期墊籩生！旦一懈碰如刪臂上海大學(xué)碩士學(xué)位論文水稻穎殼異常發(fā)育突變體和的基因圖位克隆及基因功能分析摘要利用水稻小花各輪器官發(fā)育異常的突變體來(lái)研究單子葉植物花器官發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制是目前植物分子遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)。本研究將粳稻品種進(jìn)行射線誘變，從代突變體庫(kù)中篩到兩個(gè)穎殼發(fā)育異常的突變體，分別命名為（）和（）。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期，這兩個(gè)突變體與野生型相比，沒(méi)有明顯發(fā)育異常。進(jìn)入生殖生長(zhǎng)后，花的退化穎殼（）比野生型的退化穎殼明顯增長(zhǎng)；護(hù)穎（）和野

2、生型相比也異常增長(zhǎng)；雄蕊數(shù)目減少。突變體的護(hù)穎也異常增長(zhǎng)，一次枝梗形態(tài)彎曲，數(shù)量增多。利用電子顯微鏡對(duì)和的表型特征進(jìn)行了細(xì)致的分析，表明和的突變影響水稻小穗頂端分生組織正常發(fā)育，造成小穗原基發(fā)育異常。分別對(duì)這兩個(gè)突變體進(jìn)行的遺傳學(xué)分析結(jié)果表明這兩個(gè)性狀各受一對(duì)隱性基因控制。為了對(duì)和進(jìn)行基因定位，分別將和純合體與秈稻品種廣陸矮號(hào)雜交，建立代群體，篩選代中的突變株，利用已公布的水稻系列標(biāo)記及自行設(shè)計(jì)標(biāo)記，應(yīng)用圖位克隆技術(shù)，對(duì)和位點(diǎn)進(jìn)行遺傳定位。我們將進(jìn)行了初定位和精細(xì)定位，最終將定位在號(hào)染色體上標(biāo)記與之間，遺傳距離分別為和，為進(jìn)一步克隆基因和研究水稻小穗器官發(fā)育的調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。另外，我們將精

3、細(xì)定位在號(hào)染色體上標(biāo)記和標(biāo)記之間，遺傳距離，物理距離的區(qū)段范圍內(nèi)。對(duì)其中兩個(gè)可能與花發(fā)育相關(guān)的基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示其中一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因發(fā)生突變，命名此基因?yàn)椤ｋS后，提取野生型和突變乖奉，擴(kuò)增全長(zhǎng)后測(cè)序，證明突變體中偽匹回基因內(nèi)含子剪切異常，造成移碼突變。在此基礎(chǔ)上，我們又利用干擾的方法，證明了水稻野生型的上海大學(xué)碩士學(xué)位論文基因沉默后可以產(chǎn)生突變體的表型，證明確實(shí)由于基因的突變產(chǎn)生的表型。將基因在野生型水稻中過(guò)量表達(dá)后，我們觀察到偽段玨過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生了新表型：一次枝梗數(shù)目減少，小穗夕稃頂端長(zhǎng)出刺狀器官。為研究的表達(dá)特性，我們提取了野生型水稻植株的根、莖、葉、穗、幼苗的，以瞞因作

4、參照，利用分析了在水稻生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)情況。結(jié)果表明伽瓜刀可以在水稻根、莖、葉、穗、幼苗中表達(dá)。我們還構(gòu)建了仉曰基因的原核表達(dá)載體，高效表達(dá)了蛋白，并免疫法制備了抗體。這些工作為進(jìn)一步研究在水稻小穗形態(tài)建成過(guò)程中發(fā)揮的功能奠定了良好的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：水稻（刪缸口）；護(hù)穎；退化穎殼：基因定位；功能分析上海大學(xué)碩士學(xué)位論文，（）（聊），？，）（矗），前托恤，上海大學(xué)碩士學(xué)位論文：，：（）；上海大學(xué)碩十學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人己發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果。參與同一工作的其他同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已

5、在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。簽名：至盤(pán)拉日本論文使用授權(quán)說(shuō)明瓤：瑚鑫本人完全了解上海大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留論文及送交論文復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容。（保密的論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定）簽名：至匆二移導(dǎo)師簽名：搬日期：遜?。瑚陨虾４髮W(xué)碩士學(xué)位論文第一章綜述：植物花器官發(fā)育的研究進(jìn)展雙子葉模式植物擬南芥和單子葉模式植物水稻的花器官結(jié)構(gòu)雙子葉模式植物擬南芥，花輻射對(duì)稱，第一輪是片萼片（），第二輪為片花瓣（），第三輪為枚雄蕊（），第四輪為心皮（）所構(gòu)成的復(fù)雌蕊。、單子葉植物早在億年前就和雙子葉植物開(kāi)始分開(kāi)進(jìn)化【”，發(fā)展到今天，花器官

6、形態(tài)已經(jīng)發(fā)生了很大差異。一般認(rèn)為水稻穎花（）包括片外稃（）和片內(nèi)稃（），對(duì)漿片（），個(gè)雄蕊（）和個(gè)心皮（）（圖，）。稃片下有一對(duì)護(hù)穎（，圖，），與穎花共同構(gòu)成一朵完整的小穗（）。小穗下方還有兩片退化穎殼（，圖，）。護(hù)穎和退化穎殼相當(dāng)于雙子葉植物的苞葉（）【】，其研究由于缺乏相應(yīng)的突變體而受到限制。 圖擬南芥花和水稻穎花的形態(tài)比較，退化穎殼；，護(hù)穎；，稃；聘內(nèi)稃；，漿片；，雄蕊；，心皮；，柱頭雙子葉模式植物花器官發(fā)育模型擬南芥是研究雙子葉植物花器官發(fā)育分子調(diào)控機(jī)理的模式植物，花由花萼、上海大學(xué)碩士學(xué)位論文花瓣、雄蕊和雌蕊輪花器官組成。通過(guò)對(duì)擬南芥突變體的研究，人們發(fā)現(xiàn)擬南芥中有一系列能控制花器官

7、相互轉(zhuǎn)化的基因。和一這兩個(gè)基因只要有一個(gè)缺失，花萼和花瓣就不能正常發(fā)育，花萼位置處發(fā)育出變形的雌蕊，花瓣位置處發(fā)育出雄蕊（圖，），部分發(fā)育出了新的小花和中之一發(fā)生突變都會(huì)導(dǎo)致花瓣轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄝ?，雄蕊變成心皮（圖，）。突變中，雄蕊和雌蕊無(wú)法發(fā)育，雄蕊位置處發(fā)育出花瓣，雌蕊位置處發(fā)育出花萼（圖，）。在類基因和類基因雙突變體中，類基因在各輪花器官中都具有活性，使四輪器官均變?yōu)檩嗥▓D，）。在類基因和類基因雙突變體中，類基因在各輪花器官中都具有活性，產(chǎn)生兩輪花瓣和兩輪雄蕊（圖，）。在類基因、類基因和類基因三突變體中，花的各輪器官都轉(zhuǎn)變成了葉狀結(jié)構(gòu)（圖，）。通過(guò)對(duì)這些基因的研究，人們提出了關(guān)于花器官發(fā)育決定

8、的模型理論（圖，），來(lái)揭示雙子葉植物花器官發(fā)育的遺傳控制機(jī)理【”。即在擬南芥中，花萼形態(tài)由類基因調(diào)控，花瓣形態(tài)由類和類基因共同調(diào)控，雄蕊形態(tài)由類和類基因共同調(diào)控，雌蕊形態(tài)由類基因調(diào)控。其中，類基因和類基因的活性相互抑制，類基因抑制類基因在第一輪花器官和第二輪花器官中的表達(dá)，類基因抑制類基因在第三輪花器官和第四輪花器官中的表達(dá)【】。三類基因的活性與它們?cè)诨ㄖ械奈恢脽o(wú)關(guān)。上海大學(xué)碩士學(xué)位論文 圈根據(jù)對(duì)拉南芥同源異型突變體的研究提出了模型：（）；：（）；：（國(guó)；：（）；：（唱）；：；：；：；：金魚(yú)草也是研究雙子葉植物花發(fā)育分子控制機(jī)理的模式植物，（），（）和（）分別是擬南芥中，”，和的同源基因，模型

9、對(duì)雙子葉植物花發(fā)育的調(diào)控具有保守性。年人們從矮牽牛（）中克隆到了專地在胚珠原基、珠被和珠柄中表達(dá)的和用驢，發(fā)現(xiàn)了調(diào)控胚珠發(fā)育的類基因【，。過(guò)量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株的第一輪花器官和第二輪花器官上形成了異位胚珠【】。抑制和表達(dá)，在野生型植株形成胚珠的地方發(fā)育出心皮狀或形似葉狀的結(jié)構(gòu)，命名為功能基因。之后，人們?cè)跀M南芥中克隆到了與上海大學(xué)碩士學(xué)位論文和只爐行使相同功能的基因，證明了類基因在雙子葉植物中的保守性。此后，這樣經(jīng)典模型被擴(kuò)展為模型。一如果說(shuō)類基因?qū)òl(fā)育是充分條件的話，那么在任何器官中將類基因表達(dá)，都應(yīng)該能夠產(chǎn)生花的表型。事實(shí)上，人們將類基因在葉中異位表達(dá)，無(wú)法產(chǎn)生花的器官【”】。因此，類基因

10、對(duì)花發(fā)育只是必要條件，不是充分條件。所以還存在著其他未發(fā)現(xiàn)的花誘導(dǎo)必需因子。后來(lái)，在年人們通過(guò)尋找能夠與模型中的蛋白相互作用的蛋白的方法，發(fā)現(xiàn)了參與花瓣、雄蕊和雌蕊輪器官發(fā)育的類基因【，類基因由艇（也）、（也）、（也）和（也叫上）組成，彼此之間存在功能冗余。類基因與、和類基因共同作用，參與花器官的發(fā)育調(diào)控。至此，四因子模型應(yīng)運(yùn)而生（圖）。該模型假設(shè)種花同源異形基因的不同組合決定不同花器官的特征。蛋白復(fù)合物一一？一？決定萼片形成，卜決定花瓣形成，一決定雄蕊形成，決定心皮形成（圖），這些蛋白質(zhì)復(fù)合物通過(guò)粘著在特異目標(biāo)基因的啟動(dòng)子上激活或抑制不同的器官特征基因發(fā)揮功能。不同蛋白質(zhì)復(fù)合物和序列之間親合

11、力的不同和不同基因啟動(dòng)子區(qū)域的不同決定了蛋白質(zhì)復(fù)合物和目標(biāo)基因的相互選擇。上海大學(xué)碩士學(xué)位論文 圖控制雙子葉植物花器官發(fā)育的模型【引自】上海大學(xué)碩士學(xué)位論文值得注意的是，除了一朋，控制雙子葉植物花器官發(fā)育的模型中的這些基因都有一個(gè)命名為域的保守的結(jié)合域，屬于基因家族的成員。調(diào)控單子葉植物花器官發(fā)育的分子機(jī)理的研究進(jìn)展通過(guò)研究水稻中一些與雙子葉植物模型基因同源的盒基因，人們已經(jīng)克隆了一些與水稻花器官發(fā)育相關(guān)的基因，初步分析了控制水稻花器官發(fā)育的分予機(jī)理。類基因：水稻中與相似性最高的基因是（也叫刪儺，）【“，特異在幼嫩花序及小穗分生組織中表達(dá)。小穗器官分化后，在內(nèi)外稃和漿片中表達(dá)，在護(hù)穎中也有微弱

12、表達(dá)。（也叫、）和（也叫）】與序列相似性也很高【。在水稻小穗所有部位都表達(dá)，小穗成熟后，在漿片和穎片中檢測(cè)不到其表達(dá)。起初在穎片、內(nèi)外稃中表達(dá)，小穗成熟后，只在雄蕊和心皮中檢測(cè)到表達(dá)【。盡管和與序列相似性很高，表達(dá)模式卻大不相同。姒列鉗表達(dá)模式與五，相似，還需要功能分析來(lái)確定是否一朋在水稻中的同源基因。早期在花原基各處表達(dá)，后期只在內(nèi)外稃和胚珠中表達(dá)，突變體內(nèi)外稃和漿片轉(zhuǎn)化成葉狀，部分小穗產(chǎn)生了新的小花【”，說(shuō)明有花分生組織決定作用。這個(gè)表型與相似，但是是否是類基因仍然需要鑒定。類基因：根據(jù)序列相似性，和是，是【。研究證實(shí)，（突變體命名為）和可以調(diào)控水稻花的漿片和雄蕊的特征，類基因在雙子葉植物

13、和單子葉植物進(jìn)化過(guò)程中的保守性已經(jīng)被證明講，圈，漿片被認(rèn)為與雙子葉植物中花瓣同源。類基因：研究證明，姒糾野（也叫刪）在只在雄蕊和雌蕊中表達(dá)，調(diào)控雄蕊和心皮的特征，屬于類基因瞄。類基因在雙子葉植物和單子葉植物中是保守的。在胡突變體中，心皮被同源異型轉(zhuǎn)化為雄蕊。在花發(fā)育中，基因的表達(dá)開(kāi)始于心皮原基起始的區(qū)域，并且在心皮原基中持續(xù)表達(dá)。因此，上海大學(xué)碩士學(xué)位論文基因僅特化一輪花器管的特性。從這個(gè)方面講，模型在水稻中被修改了。近期研究證明，單子葉植物和雙子葉植物分開(kāi)進(jìn)化后，類基因在單子葉植物中發(fā)生了復(fù)制，功能分離，和在水稻中共同行使了類基因功能剛。類基匿亂與和具有序列相似度叨，表達(dá)方式相似，在胚珠和心

14、皮內(nèi)層表達(dá)。與和一樣，能夠結(jié)合特異基因，來(lái)行使基因功能。說(shuō)明類基因行使基因功能的方式在雙子葉植物和單子葉植物中是保守的。類基因：系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，（也叫）、（也叫）、仇朋腳、與基因同組，親緣關(guān)系較近田】，最近的是和，早期在漿片和雄蕊原基分生組織中表達(dá)，后期在漿片、雄蕊和雌蕊原基中表達(dá)，是類基因在水稻中的候選基因。由于具有分生組織決定性，也是類基因在水稻中的候選基因。”。基因家族除了丘船，幾乎所有基因都是高度保守的，含有保守結(jié)構(gòu)域，屬于基因。來(lái)自，及蛋白的首字母。是酵母細(xì)胞類型的調(diào)節(jié)因子，是酵母精氨酸代謝基因的調(diào)節(jié)因子，與勻是花器官類別基因產(chǎn)物，則是人血清應(yīng)答因子（）。和兩個(gè)結(jié)合蛋白均識(shí)別靶序列

15、（】。該序列編碼一個(gè)與特定序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子功能的結(jié)構(gòu)域。對(duì)于維管植物而言，基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子具有保守結(jié)構(gòu)特性，也稱之為切結(jié)構(gòu)域【，即包括，（），（）和（）域。（）結(jié)構(gòu)域是由個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的區(qū)域，是與結(jié)合的主要決定因素。它形成二聚體調(diào)節(jié)與的結(jié)合。該區(qū)域可部分的折疊，形成由螺旋所形成的反向平行的螺旋卷曲螺旋，平躺于的小溝中。它識(shí)別（特征序列，該序列稱為（），它存在于許多基因的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)，因此蛋白上海大學(xué)碩士學(xué)位論文可能通過(guò)對(duì)（的調(diào)控來(lái)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。（）結(jié)構(gòu)域是一段約個(gè)氨基酸殘基的片段，與角蛋白（）部分同源，至今在動(dòng)物和真菌中還未被發(fā)現(xiàn)。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明結(jié)構(gòu)域含有個(gè)螺旋，和，與疏水

16、殘基有保守的整齊間距，能在蛋白二聚體中形成兩親和性螺旋結(jié)構(gòu)，調(diào)解蛋白質(zhì)之間的相互作用。（）在結(jié)構(gòu)域和區(qū)域之間存在一段個(gè)氨基酸的區(qū)域，含有較多親水殘基的非保守區(qū)域，幫助轉(zhuǎn)錄因子蛋白二聚體與結(jié)合形成復(fù)合體。（）結(jié)構(gòu)域下游的非保守的端主要由疏水氨基酸組成，約個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的富含疏水殘基的非保守區(qū)域，可能作為基因的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，與多聚體高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)【】。編碼具有這些區(qū)域的基因被稱為型基因。此外，在少數(shù)區(qū)上游還有一個(gè)延伸的區(qū)，具有這種結(jié)構(gòu)的基因被稱為型。如人的在區(qū)前就有一段較長(zhǎng)的延伸區(qū)。通過(guò)對(duì)人的。射線晶體衍射研究發(fā)現(xiàn)，的兩個(gè)單體以二聚體形式結(jié)合在一起，核心區(qū)由結(jié)構(gòu)域個(gè)氨基酸和延伸的約個(gè)氨基酸組成，二聚體

17、分成三個(gè)結(jié)構(gòu)單元疊加在一起。第一個(gè)結(jié)構(gòu)單元是結(jié)合區(qū)，由分別來(lái)自兩個(gè)單體的旺螺旋形成的一個(gè)反平行的螺旋卷曲螺旋。這兩個(gè)螺旋平行于其識(shí)別的的雙螺旋的小溝，并與的磷酸骨架接觸，分子包裹在螺旋卷曲螺旋的周圍，兩個(gè)螺旋的鏈端即兩個(gè)單體的段插入的雙螺旋的小溝內(nèi)和分子相結(jié)合。第二個(gè)結(jié)構(gòu)單元式四段反平行的折疊，由結(jié)構(gòu)域端和延伸的一段氨基酸組成（對(duì)應(yīng)于植物蛋白區(qū)）。第三個(gè)結(jié)構(gòu)單元即頂部，位于折疊上方，是由一個(gè)不規(guī)則的螺旋卷曲螺旋緊接著一個(gè)短的螺旋組成。由于，和在此部分結(jié)構(gòu)相似，又稱之為結(jié)構(gòu)。由于結(jié)構(gòu)與在氨基酸組成上的高度相似性，對(duì)作用機(jī)理的分析也同樣適用分析植物中的蛋白。等發(fā)現(xiàn)，植物結(jié)構(gòu)組成在功能上的分配也是和

18、相似的：端進(jìn)行結(jié)合，端主要起到形成二聚體的作用，區(qū)寸蛋白形成二聚體是必不可少的。水稻花序原基分化過(guò)程植物發(fā)育的模式與動(dòng)物相比具有顯著的差異。在動(dòng)物的個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，其形態(tài)的建成發(fā)生在胚胎發(fā)生階段（），與器官形成相關(guān)的細(xì)胞分上海大學(xué)碩士學(xué)位論文裂和分化活動(dòng)集中出現(xiàn)在這一階段。在胚后的發(fā)育階段，雖然仍然有細(xì)胞分裂和分化的發(fā)生，但這些細(xì)胞的分裂和分化的作用主要是維持器官的正常功能。而植物的形態(tài)建成主要通過(guò)分生組織（）的分裂和分化活動(dòng)，在一個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)完成。分生組織是一群未分化的、不斷分裂的細(xì)胞。在植物的胚胎發(fā)生階段，植株就形成了根端分生組織（）和莖端分生組織（），在胚胎發(fā)生后的發(fā)育過(guò)程中，頂端分

19、生組織不斷的分化形成新的側(cè)生器官】。一方面，分生組織能夠根據(jù)外界環(huán)境的刺激及內(nèi)部遺傳因子的控制，不斷的分化出根、莖、葉、枝、花等器官，以保證植物能夠完成整個(gè)生命周期；另一方面，分生組織能夠不斷的分裂，以填補(bǔ)由于器官形成過(guò)程中所消耗的細(xì)胞，以保持自身的完整性【】。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，莖端分生組織不斷分化產(chǎn)生葉原基（圖，）。進(jìn)入生殖生長(zhǎng)后，莖端分生組織分化產(chǎn)生初級(jí)枝梗分生組織（圖，）。之后，初級(jí)枝梗分生組織分化產(chǎn)生小穗枝梗分生組織（也級(jí)枝梗分生組織）、終端穗分生組織和側(cè)生穗分生組織（圖，），穗分生組織分化產(chǎn)生小穗原基。小穗原基依次分化產(chǎn)生外退化穎原基、內(nèi)退化穎原基、外護(hù)穎原基、內(nèi)護(hù)穎原基、外稃原基和內(nèi)稃

20、原基（圖，）。原基逐漸發(fā)育成器官，內(nèi)外稃閉攏，包住內(nèi)部花器官，形成完整小穗（圖，）。一個(gè)發(fā)育成熟的水稻花序示意圖見(jiàn)圖，。上海大學(xué)碩士學(xué)位論文贏：虢融：翼蜘圖水稻莖端分生組織（）發(fā)育示意圖【引自叻葉原基；，初級(jí)枝梗分生組織；，既終端穗分生組織；，側(cè)生穗分生組織；，穗枝梗分生組織；，化穎；，內(nèi)退化穎；護(hù)穎；，啪內(nèi)護(hù)穎；，稃；，內(nèi)稃；，主軸；，初級(jí)枝梗；，二級(jí)枝梗；，終端穗；，側(cè)生穗；卻，退化點(diǎn)趴上海大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章控制水稻護(hù)穎發(fā)育的基因的圖位克隆及功能分析材料和儀器水稻材料的種植及突變體來(lái)源用”射線誘變粳稻種子，處理劑量為。在代分離群體中獲得一株穎殼異常發(fā)育的突變體，將該突變體與野生型回交代

21、，獲得隱性單基因控制的的突變體。所有植物材料種植于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地。突變體的遺傳分析和定位群體的構(gòu)建將突變體與秈稻品種廣陸矮號(hào)雜交，獲得代。代自交獲得代，大田種植，出現(xiàn)表型后，選擇其中的突變植株作為定位群體。本研究中篩選到定位群體抹。水稻植株的表型觀察大田種植植株。待植株抽穗后，對(duì)野生型和突變體進(jìn)行觀察拍照。實(shí)驗(yàn)試劑及配方本實(shí)驗(yàn)所用的引物由上海博亞（英駿）生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。、和等購(gòu)自公司。水稻培養(yǎng)基購(gòu)自。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。（）（）（）（）氯仿：異戊醇氯仿：異戊醇的體積比為：（）聚丙烯酰胺母液丙烯酰胺，一亞甲雙丙烯酰胺尿素×加水至（）硝酸銀染色液在毫升水中加

22、入硝酸銀。（）顯影液在水中加入：四硼酸鈉甲醛（）固定液無(wú)水乙醇冰醋酸甲醛水（）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：母液：大量元素（）母液：）（鈣鹽（）。母液：鉀鹽（）。母液：微量元素（）。、。母液：×維生素（）甘氨酸鹽酸硫胺素鹽酸吡哆素?zé)熕峒〈寄敢海鸿F鹽（）配制培養(yǎng)基時(shí)分別加入母液、各，母液、各和母液，另加入蔗糖，調(diào)節(jié)值至，高壓滅菌（固體培養(yǎng)基加的瓊脂）。（）：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加以下物質(zhì)：干酪素蔗糖，調(diào)節(jié)值至，高壓滅菌。上海丈學(xué)碩士學(xué)位論文（）：除了，的濃度為外，其余同。（）血液體培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中添加：干酪素扎蔗糖，（乙酰丁香酮）洲調(diào)節(jié)值至，高壓滅菌。（）：中加入“乙酰丁香酮。（）：中加入的頭孢氨芐，

23、）的潮霉素。（）：中加入的頭孢氨芐，的潮霉素。（）：在含有的水（滅菌）中添溶液溶液溶液頭孢氨芐舡潮霉素（）：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加：干酪素玉米素（）上海大學(xué)碩士學(xué)位論文激動(dòng)素頭孢氨芐潮霉素蔗糖山梨醇調(diào)節(jié)值至，高壓滅菌。（）：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加：干酪素潮霉素頭孢氨芐蔗糖幾調(diào)節(jié)值至，高壓滅菌。（）檢測(cè)試劑封閉緩沖液：，：調(diào)節(jié)?，F(xiàn)配現(xiàn)用：取絡(luò)，加在皿水中，取止用稀釋至。每孔加皿。（）配制甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠所用溶液：成分配制不同體積和濃度凝膠所需各成分的體軎膠水丙烯酰胺混合液幾上海大學(xué)碩士學(xué)位論文，過(guò)硫酸銨膠水丙烯酰胺混合液（過(guò)硫酸銨功，配制甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠所用溶液：成分配制不同

24、體積和濃度凝膠所需各成分的體積，水丙烯酰胺混合液過(guò)硫酸銨（）×一甘氨酸緩沖液（）堿甘氨酸（電泳級(jí)）（）（）×凝膠加樣緩沖液（電泳級(jí)）溴酚藍(lán)甘油（）考馬斯亮藍(lán)染色液考馬斯亮藍(lán)甲醇冰醋酸上海大學(xué)碩士學(xué)位論文（）考馬斯亮藍(lán)脫色液甲醇冰醋酸實(shí)驗(yàn)儀器型擴(kuò)增儀（）型電泳槽（北京六一儀器廠）型電泳儀（北京六一儀器廠）型，高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)公司）移液器（）冰箱（）。冰箱（）冰箱（微波爐）基因?qū)雰x（寧波新芝科器研究所）潔凈工作臺(tái)（上海博迅有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）恒溫振蕩器（江蘇太倉(cāng)市試驗(yàn)設(shè)備廠）解剖鏡（型脫色搖床（上海琪特分析儀器有限公司）電子天平

25、（￥型離心機(jī)（型真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）制冰機(jī)（）自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）上海大學(xué)碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)方法法提取水稻總根據(jù)公布的提取水稻總的方法【“，稱左右的水稻葉片放入小研缽，加入適量的液氦，立刻研磨至粉末，放入的管中，可暫時(shí)保存在。中。加入止的的溶液于前離心管中，小心混勻后放入水浴搖床，搖床頻率為。后取出離心管，加入等體積氯仿：異丙醇，猛烈搖勻，離心，。取上清（注意不要帶入氯仿）于備好的新管中，加入倍體積的預(yù)冷的異丙醇（或倍的無(wú)水乙醇），先緩慢混勻，再猛烈混勻幾下，使成團(tuán)，放入以上。將析出的離心。棄上清，將沉淀用的乙醇洗

26、滌一次，離心后干燥。將沉淀溶于此或超純水中。分子標(biāo)記分析標(biāo)記根據(jù)已發(fā)表的序列合成：）。標(biāo)記的設(shè)計(jì)是根據(jù)已發(fā)表的粳稻日本晴和秈稻【刀兩品系的核苷酸序列，將粳稻與秈稻的克隆序列進(jìn)行比較，在差異序列兩側(cè)利用軟件設(shè)計(jì)引物，然后驗(yàn)證在個(gè)親本粳稻和秈稻廣陸矮號(hào)之間的多態(tài)性。程序參考蜘等人的方法【司做了部分調(diào)整。此的反應(yīng)體系中包括：州的引物，州，×（，膠），的模板，的酶。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性，循環(huán)（，）次，最后延伸。聚丙烯酰胺變性凝膠電泳和銀染采用的變性電泳和銀染的方法染色，。擴(kuò)增產(chǎn)物用聚丙烯酰胺變性凝膠電泳。包括以下三個(gè)基本操作步上海大學(xué)碩士學(xué)位論文驟。制膠：聚丙烯酰胺變性膠的配制方法是：取丙烯酰

27、胺母液，加入的過(guò)硫酸胺，此，攪勻，立即注膠；注滿后，放平玻璃板，使其與桌面成左右的角度，插入梳子；靜放個(gè)小時(shí)。點(diǎn)樣：待膠完全凝固后，小心拔出梳子，用蒸餾水反復(fù)沖洗點(diǎn)樣孔，清除多余沒(méi)有凝固的物質(zhì)；將玻璃板固定在垂直電泳槽上，加入適量的×緩沖液；取擴(kuò)增產(chǎn)物，每管加入此含溴酚藍(lán)和二甲苯氰兩種指示劑的載樣緩沖液，用微量進(jìn)樣器取止，樣品注入點(diǎn)樣孔。電泳：調(diào)電壓至，電泳時(shí)間約為。電泳完畢后，將玻璃板從電泳槽上拆下，取出凝膠，在蒸餾水中漂洗兩次，每次約；轉(zhuǎn)入溶液中，在搖床上輕搖，染色：然后將凝膠轉(zhuǎn)移到蒸餾水中漂洗兩次；最后轉(zhuǎn)入顯影液中顯色，著色后轉(zhuǎn)入水中保存。凝膠成像，數(shù)碼相機(jī)拍照記錄結(jié)果。群體分

28、離分析方法根據(jù)公布的群體分離方法（，）】，從分離群體中隨機(jī)取個(gè)樣品取等量葉片混合提取構(gòu)建一個(gè)突變池（或者分別提取然后取等量混合），以突變池為模板，用覆蓋基因組的分子標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)擴(kuò)增兩親本和雜交代模板作為對(duì)照。在突變池中與突變基因連鎖的座位的遺傳背景偏向突變體來(lái)源的親本，通過(guò)凝膠分析可以看出，突變體來(lái)源的親本條帶和對(duì)照相同，而用于雜交的另一親本條帶沒(méi)有或弱于對(duì)照。連鎖分析根據(jù)公布的連鎖分析方法，用篩選出來(lái)的多態(tài)性分子標(biāo)記對(duì)定位群體中的突變株進(jìn)行基因型分析，利用構(gòu)建目標(biāo)基因區(qū)域的分子標(biāo)記的連鎖圖譜。上海大學(xué)碩士學(xué)位論文掃描電鏡觀察掃描電鏡的觀察參考等人的方法作了部分調(diào)整【】。（）材料固定

29、：固定液固定樣品，小時(shí)以上。（）材料脫水：，乙醇梯度脫水，每級(jí)，脫水劑體積高于材料的倍。（）臨界點(diǎn)干燥。（）上銅臺(tái)：將樣品用導(dǎo)電膠固定于銅臺(tái)上，并將樣品調(diào)整至適于觀察的位置。（）樣品噴金。（）掃描電鏡觀察。水稻的幼胚轉(zhuǎn)化及組織培養(yǎng)水稻幼胚轉(zhuǎn)化及組織培養(yǎng)參照【和等人的方法作了部分調(diào)整。（）幼胚材料的預(yù)處理采集受粉后一天未成熟的種子，在這個(gè)時(shí)期的胚乳相對(duì)固化，但仍成乳狀。將去殼種子在乙醇中浸泡后，在漂白劑（含）中滅菌。無(wú)菌水洗次。在無(wú)菌條件下有手術(shù)刀和鑷子解剖幼胚。將幼胚直接轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基平板中。暗培養(yǎng)天。當(dāng)黃色愈傷組織在胚軸出現(xiàn)時(shí)（通常需要四天，在這期間，根通常有長(zhǎng)），切除根部和胚乳，將胚軸轉(zhuǎn)移至一個(gè)新鮮的培養(yǎng)基平板，鈍形面向下。暗培養(yǎng)天。（）挑取農(nóng)桿菌單菌落，在加卡那霉素的培養(yǎng)基基中震蕩培養(yǎng)約（，），至為。（）離心，在液體培養(yǎng)基中重懸沉淀至濃度為。（）將個(gè)帶有黃色愈傷的胚浸泡在細(xì)菌懸液中，間或震蕩。（）從懸液中收集胚，在兩張無(wú)菌濾紙間吸干。（）在培養(yǎng)基平板表面放上無(wú)菌濾紙，把胚放在濾紙表面，暗培養(yǎng)天。（）把胚的根部去掉，把胚放入培養(yǎng)基平板上，切割面向下，暗培養(yǎng)天。（）再轉(zhuǎn)入新鮮的的培養(yǎng)基平板上暗培養(yǎng)天。在這個(gè)時(shí)間可以看見(jiàn)新的愈傷長(zhǎng)出。（）把抗性愈傷（將抗性愈傷從胚上切下）放在預(yù)分化培養(yǎng)基（）平板上海大學(xué)碩士學(xué)位論文上，暗培養(yǎng)天。（）把愈傷放在生芽培養(yǎng)基培養(yǎng)基平板上，（小時(shí)光照，