條件性缺氧誘導(dǎo)因子-1α RNAi轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立_圖文

1、生 物 工 程 學(xué) 報(bào) Chin J Biotech2008, January 25; 24(1: 27-32 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061cjb©2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved. 條件性缺氧誘導(dǎo)因子 -1 RNAi轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立戚華兵 , 宋瑞華 , 杜曉蘭 , 趙 玲 , 蘇 楠 , 劉道誠 , 李福兵 , 陳 林第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所全軍創(chuàng)傷中心 , 創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 , 重

2、慶 400042摘 要 :缺氧誘導(dǎo)因子 1 (hypoxia inducible factor-1 , HIF-1 是細(xì)胞在缺氧等條件下穩(wěn)定表達(dá)的具有轉(zhuǎn)錄活性的蛋白 , 通過與多種靶基因調(diào)控區(qū)的缺氧反應(yīng)元件 (hypoxia response element, HRE結(jié)合 , 調(diào)控靶基因表達(dá) , 使機(jī)體對(duì)缺氧、缺血等病理生理過程產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)。為從整體動(dòng)物水平研究 HIF-1 的作用 , 需要建立 HIF-1 相關(guān)遺傳修飾小鼠。分別針對(duì) HIF-1 mRNA序列的兩個(gè)靶位點(diǎn)合成兩對(duì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈 , 構(gòu)建可誘導(dǎo)的 RNA 干擾真核表達(dá)載體 HIF-AB和 HIF-CD 。分別將 CRE 重組

3、酶真核表達(dá)載體 CRE-ER T2與 HIF-AB 或 HIF-CD 轉(zhuǎn)染入 RAW264.7細(xì)胞 , 篩選得到穩(wěn)定表達(dá) CRE-ER T2與 HIF-AB, 或 CRE-ER T2與 HIF-CD 的穩(wěn)定細(xì)胞系。 在用 4-HT 誘導(dǎo)去除上述細(xì)胞系中 HIF-AB 或 HIF-CD所含的 Neo 基因后 , 用 CoCl 2誘導(dǎo) HIF-1 表達(dá) , 采用半定量 RT-PCR 檢測(cè) HIF-AB 或 HIF-CD 對(duì) HIF-1 基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾載體 (HIF-AB和 HIF-CD 對(duì) HIF-1 mRNA序列的沉默效果分別為 85%和 72%。選擇干擾效率較高的表達(dá)載體 HIF

4、-AB 經(jīng)顯微注射獲得 HIF-1 基因敲低小鼠模型 , 經(jīng) PCR 以及測(cè)序驗(yàn)證獲得 2個(gè)轉(zhuǎn)基因陽性小鼠 (Founders, G0代 。 G 0代雄鼠與 FVB/N雌鼠交配后獲得 2只 F 1代 (first filial generation轉(zhuǎn)基因陽性小鼠 , 經(jīng)與 EIIA-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配 , 得到 EIIA-Cre; HIFRNAiflox/+小鼠 , RT-PCR結(jié)果顯示 , EIIA-Cre; HIFRNAiflox/+小鼠肝、肺、 腎等組織的HIF-1 mRNA水平明顯降低 , 分別約為正常對(duì)照的 44%、 38.2%和 23.5%。該小鼠模型的建立為進(jìn)一步研究 HIF-

5、1 的功能及作用機(jī)制提供了新的手段。關(guān)鍵詞 : 缺氧誘導(dǎo)因子 -1, 發(fā)夾狀小干涉 RNA, 轉(zhuǎn)基因小鼠Generation of Inducible HIF-1 RNAi Transgenic MiceHuabing Qi , Ruihua Song , Xiaolan Du, Ling Zhao, Nan Su, Daocheng Liu, Fubing Li, and Lin ChenTrauma Center, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University; State

6、 Key Laboratory of Trauma, Burns andCombined Injury, Chongqing 400042, ChinaAbstract : Hypoxia inducible factor-1 (HIF-1 is a transcription factor that responds to changes in oxygen concentration. In this study, we constructed two vectors, HIF-AB and HIF-CD, to transcribe functional short interferin

7、g RNA against different region ofmouse HIF-1 . The oligonucleotide encoding small hairpin RNAs against mouse HIF-1 was inserted into the downstream of U6 promoter of pBSK/U6-NEO plasmid. Cre-expression vector CRE-ERT2 with either HIF-AB or HIF-CD was transfected into RAW264.7 cell line, after select

8、ion with G418 and hygromycin, to obtain cell lines with stabilized expression of CRE-ERT2 andReceived : December 19, 2006; Accepted: January 17, 2007.Supported by: the National Key Basic Research and Development Plan of China (“ 973” Projects (Nos. G1999054203 and 2005 CB522604 and theNational Natur

9、al Science Foundation of China (No. 30370318.Corresponding author: Lin Chen. Tel: +86-23-68757041; E-mail: linchen70 為共同第一作者。 They are the co-first authors.國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展項(xiàng)目 (973計(jì)劃 (No. G1999054203 and No. 2005CB522604; 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No. 30370318。28 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech January 25, 20

10、08 Vol.24 No.1JHIF-AB, or CRE-ERT2 and HIF-CD. The expression levels of HIF-1 of these stable cell lines were detected by semi-quantitative RT-PCR following treatment of CoCl2, a HIF-1 expression inducer. The HIF-1 mRNA expression was reduced by 85% and 72% by HIF-AB and HIF-CD respectively. HIF-AB

11、vector was microinjected into pronucleus of zygotes to generate transgenic mice. We got two founder and two first filial generation transgenic mice containing HIF-AB and these transgenic mice were crossed with EIIA-Cre transgenic mouse to get EIIA-Cre;HIFRNAiflox/+ mice. The conditional knock down m

12、ice were viable and developed nor-mally. The results of RT-PCR indicated that the HIF-1 mRNA expression of liver, lung and kidney were reduced significantly com-pared with the normal control.Keywords : HIF-1 , shRNA, transgenic mice缺 氧 誘 導(dǎo) 因 子 -1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1 是細(xì)胞在缺氧等條件下穩(wěn)定表達(dá)的具有轉(zhuǎn)錄

13、 活性的核蛋白 , 它能夠與靶基因調(diào)控序列中的 HRE 相結(jié)合 , 誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)變化 , 介導(dǎo)機(jī)體對(duì)缺氧、 缺血產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)。目前已確定的 HIF-1靶基因 近 50種 1, 其中包括 EPO 2、轉(zhuǎn)鐵蛋白、 VEGF 等 一系列功能重要的蛋白質(zhì)。 HIF-1是由 亞基和 亞 基組成的異源二聚體 , HIF-1在一般情況下很穩(wěn)定 , 對(duì) HIF-1 的調(diào)節(jié)通常發(fā)生在 HIF-1。 氧濃度是調(diào)節(jié) HIF-1蛋白水平和功能的重要因素 , 在常氧條件下 , HIF-1亞基被蛋白酶所降解 ; 缺氧時(shí) , HIF-1降解 減少 , HIF-1蛋白水平提高 , 促轉(zhuǎn)錄活性增加 3。為更好地研究 HI

14、F-1在體內(nèi)的功能及相應(yīng)生物 學(xué)機(jī)制 , 研究者建立了 HIF-1條件性敲除小鼠模型 , 但遺憾的是在全身 4、血管內(nèi)皮 5以及軟骨細(xì)胞 6敲除 HIF-1基因的小鼠在胚胎期或出生后即死亡 , 難以進(jìn)一步研究 HIF-1基因的功能。如能部分降低 HIF-1的表達(dá)或功能 , 可望獲得能存活的 HIF-1在 特定細(xì)胞表達(dá)降低的小鼠模型。 RNAi 技術(shù)的發(fā)展, 為實(shí)現(xiàn)靶基因表達(dá)的部分降低提供了可能。在較早 的哺乳動(dòng)物 RNAi 實(shí)驗(yàn)中 , siRNAs通過體外化學(xué)方 法或體外轉(zhuǎn)錄合成 , 基因沉默效應(yīng)可以持續(xù)幾天 , 甚 至可遺傳給子代細(xì)胞 , 但最終還是會(huì)消失的。為了 能夠達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間沉默基因的目

15、的 , 研究者開發(fā)出能 夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中持續(xù)表達(dá) siRNAs 的表達(dá)載體。 Svoboda 7首先嘗試使用可以表達(dá)短發(fā)夾狀 RNAs (small hairpin RNAs, shRNAs的質(zhì)粒表達(dá)載體 , 與 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 siRNA 相比 , 質(zhì)粒表達(dá)載體引發(fā)的 RNAi 效果相當(dāng)甚至更好。近年來還建立了基于四環(huán)素 8、 蛻皮素 9反應(yīng)元件以及 Cre-LoxP 系統(tǒng) 10的可誘導(dǎo)表 達(dá) shRNA 的質(zhì)粒表達(dá)載體。 Coumoul 11等成功地運(yùn) 用基于 Cre-LoxP 系統(tǒng)的表達(dá)載體獲得了能夠在特定 組織中降低 FGFR2表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠。 為獲得在特定細(xì)胞或組織部分降低 HIF-1

16、表達(dá)的小鼠模型 , 本 文針對(duì) HIF-1構(gòu)建了基于 Cre-LoxP 系統(tǒng)的可誘導(dǎo) 表達(dá)短發(fā)夾狀 RNA 的真核表達(dá)載體 , 并建立了 RNAi 轉(zhuǎn)基因小鼠。 經(jīng)與現(xiàn)有的 Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠交配 , 獲得了在不同器官組織特異性敲低 HIF-1基因的小 鼠模型。1 材料與方法1.1 材料小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系 RAW264.7由重慶醫(yī)科大 學(xué)徐曉玉教授惠贈(zèng)。 pBSK/U6-NEO真核表達(dá)載體由 NIH 鄧初夏教授惠贈(zèng) , CRE重組酶真核表達(dá)載體 CRE-ER T2由 Chambon P.P教 授 惠 贈(zèng) 。 轉(zhuǎn) 染 試劑 Lipofectamin 2000TM 、 Trizol、 RT-PCR

17、 相關(guān)試劑均 購于 Invitrogen 公司。 限制性內(nèi)切酶、 工具酶等購自 TaKaRa 公司。 測(cè)序試劑為美國 ABI 公司產(chǎn)品。 細(xì)胞 培養(yǎng)液、小牛血清等為 Hyclone 公司產(chǎn)品。 4-HT 購 自 Sigma 公司 , G418、潮霉素為 Roche 公司產(chǎn)品。 其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2 方法1.2.1 載體 HIF-AB 和 HIF-CD 構(gòu)建GenBank 查找 HIF-1 cDNA全長(zhǎng)序列 , 應(yīng)用 Qiagen 公司 RNAi 設(shè)計(jì)軟件并參考有關(guān)文獻(xiàn) , 設(shè)計(jì) 針對(duì) HIF-1進(jìn)行 RNAi 的兩個(gè)靶點(diǎn) , 進(jìn)行 Blast 基因 同源性分析以保證基因沉默的特異性

18、, RNA Draw軟 件分析 mRNA 二級(jí)空間結(jié)構(gòu)。為避免編碼發(fā)夾狀 siRNA 的 DNA雙鏈在復(fù)性過程中發(fā)生自身折疊 , 降低連接效率 , 將發(fā)夾狀 siRNA DNA雙鏈從莖環(huán) 處分為兩段分別人工合成 , 其序列分別為 : HIF-1A: 5 -GGCG GCG AGA ACG AGA AGA AA-3 , HIF-1B: 5 -AGC TTT TCT TCT CGT TCT CGC CCGC-3 ; HIF-2A: 5 -AGC TTT TCT TCT CGT TCT CGC CGCC CTT TTT G-3 , HIF-2B: 5 AAT TCA AAA AGGG CGG CGA

19、 GAA CGA GAA GAA A-3 。戚華兵等 : 條件性缺氧誘導(dǎo)因子 -1 RNAi 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立29 J養(yǎng)液中維持培養(yǎng)。將獲得的抗性克隆細(xì)胞以 5×105/孔接種 6孔培養(yǎng)板 , 按上述方法轉(zhuǎn)染 HIF-AB 和 HIF-CD 質(zhì)粒 , 所用選擇性培養(yǎng)基 G418濃度為 500 g/mL, 潮 霉 素 濃 度 100 g/mL, 同 時(shí) 轉(zhuǎn) 染 pBSK/U6-NEO質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。 經(jīng)過兩次篩選得 到 的 陽 性 克 隆 細(xì) 胞 命 名 為 RAW-CRE-HRAB 和 RAW-CRE-HRCD 。在培養(yǎng)液中加入 4-HT(1 mol/L誘導(dǎo) CRE 重組酶表達(dá)

20、 , 96 h后在培養(yǎng)液中加入化學(xué) 缺氧劑 CoCl 2 (150 mol/mL誘導(dǎo) HIF-1表達(dá)。 培養(yǎng) 24 h后 , 收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。 HIF-1C: 5 -GGC CAT ATT CAT GTC TAT GAA A- 3 , HIF-1D: 5 -A GCT TTC ATA GAC ATG AAT ATG GCC-3 ; HIF-2C: 5 -GC TTT CAT AGA CAT GAA TAT GGC CCT TTT TG-3 , HIF-2D: 5 -AAT TCA AAA AGG GCC ATA TTC ATG TCT ATG AA-3 。 HIF-AB 和 HIF

21、-CD 載體構(gòu)建過程見圖 1。 選取 RNA 干擾效率較高的載體 , 以 Afl III和 Kpn I酶切 , 回收 大小為 2.7 kb的片段用于顯微注射。1.2.2 HIF-AB 和 HIF-CD 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 RAW264.7細(xì)胞整個(gè)轉(zhuǎn)染過程參照 Lipofectamine 2000TM 說明 書進(jìn)行。簡(jiǎn)言之 , 轉(zhuǎn)染前 24 h, RAW264.7細(xì)胞以 5×105/孔接種 6孔培養(yǎng)板 , 真核表達(dá)載體 CRE-ER T2與轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000TM 按 1:3混合 , 逐滴 加入 opti-MEM I培養(yǎng)液中孵育 6 h后 , 改用完全培 養(yǎng)基 (1

22、0%小牛血清 , 37°C, 5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng) 48 h, 加入潮霉素 (300 g/mL進(jìn)行篩選 , 約 3周后獲得 抗性細(xì)胞 , 獲得的抗性細(xì)胞于潮霉素濃度 100 g/mL培1.2.3 半定量 RT-PCR 檢測(cè)收獲培養(yǎng)細(xì)胞 , Trizol法提取細(xì)胞總 RNA, RNA定量為 500 ng/L 并進(jìn)行電泳純度檢測(cè) , 逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈 , 引物設(shè)計(jì)如下 : HIF-1 sense: 5 -CCC AAA GAC AAT AGC TTC GC-3 ; HIF-1 antisense:5 -CTG CCT TGT ATG GGA GCA TT-3 ; -act

23、in sense: 5-TTG TTA CCA ACT GGG ACG ACA圖 1 RNAi 表達(dá)載體的構(gòu)建Fig. 1 Construction of RNAi expression vector30 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech January 25, 2008 Vol.24 No.1 JTGG-3 ; -actin antisense: 5 -GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG-3 。 2%瓊脂糖電泳鑒定產(chǎn)物 , Bio-Rad 凝膠分析軟件進(jìn)行灰度值分析。以目的產(chǎn) 物 /內(nèi)參照的灰度值比值表示結(jié)果。 1.

24、2.4 轉(zhuǎn)基因注射取 45周齡的 FVB/N雌鼠 , 超排后取卵 , 將純 化的 DNA(用注射緩沖液稀釋至 2.5 ng/L 經(jīng)顯微注 射到受精卵原核中 , 再將注射后的卵移植到假孕鼠 的輸卵管 , 每只假孕鼠的輸卵管單側(cè)移卵約 20枚。 1.2.5 小鼠基因組 DNA 的提取待小鼠 10日齡后剪取鼠尾 0.5 cm, 加入含有 2 L 蛋白酶 K (10mg/mL的組織裂解液 200 L, 56°C消 化過夜。離心取上清 , 無水乙醇沉淀 , 70%酒精洗滌 , 稍晾干后溶解于 200 L TE緩沖液中。 1.2.6 PCR 及測(cè)序鑒定轉(zhuǎn)基因陽性鼠選取 RNA 干擾片段以及 NE

25、O 基因上的引物 TW13用于轉(zhuǎn)基因陽性鼠的鑒定。 TW13: 5 -CAG CTC ATT CCT CCC ACT CAT GAT-3 ; HIF-1B、 HIF-1C 序列如下所示 , 分別位于 NEO 基因序列 和 siRNA 片段上。轉(zhuǎn)基因陽性小鼠應(yīng)擴(kuò)增出大小為 583 bp的片段 , 而野生型小鼠則不能擴(kuò)增出相應(yīng)片段。HIF-AB :GCAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCT AGAGTCGACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATCCCTTGGAGAAA AGC

26、CTTGTTTG ANNNNN NNNAGCTTGACATGATTACGCCAAGCGCGCATTACCCTCACTA AAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCC GCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGG AAAAGGGCGAGAACGAGAAGAAA AGCTANNN HIF-CD :ACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGT TTTGAGACTATAAATATCCCTTGGAGAAAAGCCTTGTTT GGCCATATTCATGTCTATGAAA TNCCCNNNNAACCAAAANTGGG

27、ANCTCCCCGCGGTGGCGGCCNTCNTCGACT AGTGGGATCCCCCGGGNTGCAGGAATTCAAAAAGGGCCATATTCATGTCTATGAAA NNNNNN1.2.7 條件敲除小鼠的鑒定以及組織 HIF-1 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)上述得到的陽性 F1代轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)與 EIIA-Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠交配 , 提取小鼠基因組 DNA 行 PCR 鑒 定 , 所用引物為 HIF1B 和 TW12。 HIF1B 序列見前 , TW12: 5 -ATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTC-3 。 得到的 EIIA-Cre; HIFRNAiflox/+小鼠生

28、長(zhǎng)至2月時(shí) , 處死 , Trizol法提取心臟、 肝臟、 肺臟、 腎臟 等組織總 RNA, 取 1 g 總 RNA 為模板合成 cDNA 第一鏈 , 然后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。 1.2.8 統(tǒng)計(jì)處理采用 SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件, 樣本顯著性分析 用配對(duì) t 檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因注射片段的純化為減少 RNA 干擾片段回文結(jié)構(gòu)造成的測(cè)序難 度 , 將重組質(zhì)粒用 Hin d III酶切后回收酶切產(chǎn)物進(jìn) 行測(cè)序分析 , 證實(shí)已將針對(duì)序列的兩個(gè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的 寡核苷酸雙鏈克隆入真核表達(dá)載體 , 插入序列完全 正確 , 這兩個(gè)載體分別命名為 HIF-AB 和 HIF-CD 。 測(cè)

29、序結(jié)果如下 (加框部分為本研究插入的 HIF-1 shRNA 序列 。 表達(dá)載體 HIF-AB 酶切獲取轉(zhuǎn)基因注 射片段電泳圖見圖 2。圖 2 HIF-1 RNAi-AB 酶切圖譜Fig. 2 HIF-1 RNAi-AB cut with Afl III and Kpn I1: /Hin d III marker; 2: RNAi vector cut with Afl III and Kpn I2.2 RAW264.7細(xì)胞 HIF-1 mRNA水平表達(dá)檢測(cè)構(gòu) 建 CRE-ER T2與 HIF-AB 和 CRE-ER T2與 HIF-CD 穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系后 , 經(jīng) 1 mol/L的 4-HT

30、 誘導(dǎo) CRE-ER T2表達(dá) CRE 重組酶 , 通過 RT-PCR 來檢 測(cè)構(gòu)建的載體的 RNAi 效率 , 結(jié)果見圖 3所示。 HIF-1和 -actin 相 對(duì) 應(yīng) 的 擴(kuò) 增 片 段 大 小 分 別 為 306 bp和 382 bp。結(jié)果表明 , 針對(duì)兩個(gè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的 短發(fā)夾狀 RNA 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 RAW264.7細(xì)胞后 , HIF-1 mRNA表達(dá)水平明顯受到抑制。 以目的產(chǎn)物 /內(nèi)參照的灰度值比值進(jìn)行半定量分析 , 與未轉(zhuǎn)染組 相比 , 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中 HIF-1的表達(dá)分別下降了 85%和 72%, 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P <0.05, 而陰性對(duì)照組之 間沒有顯著性差異。戚

31、華兵等 : 條件性缺氧誘導(dǎo)因子 -1 RNAi 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立31 J圖 3 RAW264.7細(xì)胞內(nèi) HIF-1 mRNA表達(dá)變化Fig. 3 The changes of HIF-1 mRNA expression inRAW264.7 cells1: pBSK/U6-NEO empty vector transfection group; 2: HIF-1 shRNAi vector (A: HIF-AB; B: HIF-CD transfection group; 3: negative control;46: -actin; 7: DL2000 marker2.3 轉(zhuǎn)基因陽性鼠的

32、鑒定以 PCR 法鑒定所得小鼠 , 共獲得 G 0代 HIF-1 RNAi 陽性鼠 2只 , F1代 2只。見圖 4。對(duì)這些陽性 鼠 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證 , 證實(shí)所得 G 0代和 F 1代 陽性鼠的基因組中均含有注射的目的片段。圖 4 PCR 鑒定 HIF-1RNAi 轉(zhuǎn)基因小鼠Fig. 4 Identification of transgenic mouse by PCRA:identification of founder transgenic mouse. 15: mouse tails;6: DL2000 marker; 7: positive control; 8: negat

33、ive control B: identification of F1 transgenic mouse. 14: mouse tails; 5: DL2000marker; 6: positive control; 7: negative control2.4 條 件 敲 低 小 鼠 的 獲 得 以 及 組 織 HIF-1mRNA 表達(dá)水平的檢測(cè)經(jīng) 與 EIIA-Cre 轉(zhuǎn) 基 因 小 鼠 交 配 , 得 到 的 EIIA-Cre; HIFRNAiflox/+小鼠生長(zhǎng)良好 , 至 2月時(shí) , 提 取心臟、 肝臟、 肺臟、 腎臟等組織總 RNA, 行 RT-PCR 檢測(cè) HIF-1 mRNA表

34、達(dá)水平 , 結(jié)果如圖 5所示。 結(jié) 果表明 , 與全身各組織均表達(dá) Cre 的轉(zhuǎn)基因小鼠交 配得到的小鼠 , 肝臟、肺臟、腎臟等組織中 HIF-1 mRNA 具有不同程度的降低。與同窩的正常對(duì)照相 比 , 肝組織約降低了 56%, 肺組織約降低了 62%, 腎 臟組織約降低了 77%(P <0.05。圖 5 條件敲低小鼠中 HIF-1 mRNA的表達(dá)變化Fig. 5 The expression of HIF-1 mRNA in the inducibleRNAi mouseM: DL2000 marker; N: normal Control mouse; RNAi: EIIA-Cre

35、;HIFRNAi flox/+mouse3 討論氧穩(wěn)態(tài)是機(jī)體或細(xì)胞正常功能所必需的。低氧 現(xiàn)象可見于胚胎發(fā)育等生理過程 , 也是腫瘤、心血 管疾病等許多疾病發(fā)病過程中的一個(gè)重要病理因 素。大量研究表明 HIF-1靶基因的編碼產(chǎn)物在胚胎 發(fā)育、血管生長(zhǎng)與重塑、紅細(xì)胞生成、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、 糖酵解、離子代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖分化、炎 癥、 腫瘤生長(zhǎng)、 浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移等諸多方面起重要作用 1,3。 HIF-1是由 HIF-1和 HIF-1組成的異源二聚體 ,HIF-1對(duì)低氧敏感 , 是 HIF-1的特異性氧調(diào)節(jié)亞基 , 決定 HIF-1的生物活性 , 因此目前對(duì) HIF-1的研究主 要側(cè)重于對(duì) HIF-1

36、的研究。 建立去除或降低某個(gè)基因的遺傳工程小鼠 , 是 研究基因功能的有效方法之一。常規(guī)基因敲除技術(shù) 雖然有效 , 但費(fèi)用高、周期長(zhǎng)且失敗的風(fēng)險(xiǎn)較大。 反義技術(shù)以及核酶技術(shù)雖然比較簡(jiǎn)單 , 卻存在效果 較差 , 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。 自從 RNAi 現(xiàn)象發(fā)現(xiàn) 以來 , 許多學(xué)者運(yùn)用 RNAi 技術(shù)在植物、 線蟲、 果蠅 等低等動(dòng)植物以及哺乳動(dòng)物中進(jìn)行了大量研究 , 并 顯 示 不 同 長(zhǎng) 度 的 雙 鏈 RNA(double strand RNA, dsRNA 可以使不同類型細(xì)胞的靶基因表達(dá)明顯下 降甚至沒有表達(dá)。由于 RNAi 技術(shù)簡(jiǎn)便、快捷、高 效 , 如今成為遺傳學(xué)研究的一把利器。 2

37、005年比利 時(shí)生物公司 Galapagos 利用腺病毒表達(dá)的抗 4900個(gè) 藥物標(biāo)靶的 shRNAs 對(duì)基因組高通量篩選 , 找到了 包括關(guān)節(jié)炎、哮喘和阿爾茨海默病在內(nèi)的多種藥物 標(biāo)靶 14。 Song 15等通過鼠尾靜脈注射合成的小鼠 Fas 基因的特異性 siRNA 片段 , 特異性的沉默了小 鼠肝細(xì)胞 Fas 蛋白的表達(dá)。 Gupta 8和 Wang 9分別建 立了基于四環(huán)素和蛻皮素反應(yīng)元件的可誘導(dǎo)表達(dá)32 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech January 25, 2008 Vol.24 No.1 siRNA 的真核 shRNAs 表達(dá)載

38、體, 利用這一技術(shù)實(shí) 現(xiàn)了靶基因的可誘導(dǎo)性沉默。 本研究利用可以穩(wěn)定表達(dá) shRNA 的真核表達(dá) 載體 pBSK/U6-NEO, 該載體在 pol III 啟動(dòng)子的近端 調(diào)控序列和遠(yuǎn)端調(diào)控序列之間插入兩端帶有 LoxP 的 NEO 基因, TATA 序列下游為對(duì)應(yīng)目的基因特異 序列的、帶有 45 個(gè) T 的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)、其 RNA 能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 DNA 序列。 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成了針 對(duì) HIF-1基因的特異性 siRNA 片段, 將復(fù)性后的 siRNA 片段插入 pBSK/U6-NEO, 構(gòu)建 HIF-1 siRNA 真核表達(dá)載體, 經(jīng) PCR、測(cè)序驗(yàn)證所插入的片段正 確無誤。將該載體轉(zhuǎn)入已

39、轉(zhuǎn)染了 CRE-ERT2 質(zhì)粒的 RAW264.7-CRE 細(xì)胞系, CRE-ERT2 表達(dá)載體在 4-HT 的誘導(dǎo)下表達(dá) CRE 重組酶, 位于 pol III 啟動(dòng)子近端 調(diào)控序列和遠(yuǎn)端調(diào)控序列之間 NEO 基因被重組去除, pol III 啟動(dòng)子功能恢復(fù), 轉(zhuǎn)錄形成雙鏈 siRNA 片段, 干預(yù) HIF-1轉(zhuǎn)錄, 下調(diào) HIF-1蛋白表達(dá)。 結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi) HIF-1 mRNA 水平較對(duì)照組分別下 降 85%和 72%, 選取干擾效率較高的表達(dá)載體進(jìn)行 顯位注射獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。經(jīng)顯微注射獲得的轉(zhuǎn)基 因小鼠與組織特異性表達(dá) CRE 的相關(guān)轉(zhuǎn)基因小鼠交 配后即可實(shí)現(xiàn)組織特異性的 H

40、IF-1基因敲降。由于 血管內(nèi)皮細(xì)胞 5和軟骨細(xì)胞 6敲除 HIF-1 在全身 4、 后小鼠在胚胎早期或出生后即發(fā)生死亡, 提示在內(nèi) 皮、軟骨等細(xì)胞高效率降低 HIF-1可導(dǎo)致胚胎期或 出生后早期死亡, 而我們建立的 HIF-1 RNAi 轉(zhuǎn)基 因小鼠可望在內(nèi)皮、軟骨細(xì)胞等細(xì)胞或全身只部分 敲低 HIF-1水平, 從而建立可存活的在內(nèi)皮、軟骨 等細(xì)胞或全身降低 HIF-1的小鼠模型。經(jīng)過與全身 表達(dá)的 EIIA-Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠交配, 我們獲得了可在 全身各組織降低 HIF-1 mRNA 水平的 EIIA-Cre; HIFRNAiflox/+小鼠。降低 HIF-1 mRNA 水平的小鼠 發(fā)育

41、正常, 與同窩的正常對(duì)照小鼠之間無明顯的異 常。經(jīng)過 RT-PCR 證實(shí), 該小鼠肝、肺、腎臟等組織 HIF-1 mRNA 水 平 明 顯 降 低 , 約 為 正 常 對(duì) 照 的 44%、38.2%和 23.5%。與傳統(tǒng)條件性敲除動(dòng)物模型 的建立方法相比, 本研究采用的方法具有簡(jiǎn)便快 捷、費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn)。此外, 由于 RNAi 具有放大效 應(yīng) i, 僅雜合子 RNAi 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物即可出現(xiàn)表型, 縮 短了傳統(tǒng)基因敲除(條件性敲除動(dòng)物模型獲取純合 子的繁殖時(shí)間。盡管目前 RNAi 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)還 存在著降低靶基因表達(dá)不如常規(guī)基因敲除高、特異 性相對(duì)較差等不足之處, 但隨著 RNAi 技術(shù)的不斷

42、發(fā)展, 這一方法將逐漸成為研究基因功能的一個(gè)有 J 力手段。 REFERENCES 1 Semenza GL. Signal transduction to hypoxia-inducible factor 1. Biochem Pharmacol, 2002, 64(56: 993998. 2 Stockmann C, Fandrey J. Hypoxia-induced erythropoietin production: a paradigm for oxygen-regulated gene expression. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2006, 3

43、3(10: 968979. 3 Semenza GL. HIF-1 and mechanisms of hypoxia sensing. Curr Opin Cell Biol, 2001, 13(2: 167171. 4 Iyer N V, Kotch LE, Agani F, et al. Cellular and developmental control of O2 homeostasis by hypoxiainducible factor 1. Genes Dev, 1998, 12: 149162. 5 Licht AH, Muller-Holtkamp F, Flamme I,

44、 et al. Inhibition of hypoxia-inducible factor activity in endothelial cells disrupts embryonic cardiovascular development. Blood, 2006, 107(2: 58490. 6 Schipani E, Ryan HE, Didrickson S, et al. Hypoxia in cartilage: HIF-1 is essential for chondrocyte growth arrest and survival. Genes & Development, 2001, 15 (9: 28652876. 7 Svoboda P, Stein P, Schultz RM. RNAi in mouse oocytes and premplantation embryos: effectiveness of haperin dsRNA. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 87: 10991104. 8 Gupta S, Schoer RA., Egan JE, et al. Inducible, reversible, a