異基因造血干細(xì)胞移植后人類巨細(xì)胞病毒pp65的監(jiān)測及療效、危險因素分析(1)

1、    異基因造血干細(xì)胞移植后人類巨細(xì)胞病毒pp65的監(jiān)測及療效、危險因素分析(1)    】 本研究探討異基因造血干細(xì)胞移植(allo HSCT)后受者外周血白細(xì)胞巨細(xì)胞病毒(CMV) pp65抗原陽性細(xì)胞數(shù)的變化及臨床意義。以104例HSCT受者為研究對象，采集移植前后及恢復(fù)期受者的抗凝血標(biāo)本，用CMV pp65單克隆抗體熒光免疫組織化學(xué)法檢測CMV早期抗原，并進(jìn)行動態(tài)觀察。結(jié)果表明： 104例HSCT受者中29例移植后檢出CMV pp65抗原陽性，檢出率27.88%，其中16例為CMV血癥，13例為CMV病。

2、29例經(jīng)抗病毒治療后25例抗原轉(zhuǎn)為陰性，有效率86.21%，死亡4例，病死率13.79%。CMV感染患者中，受非血緣或單倍體相合異基因HSCT的患者與受同胞全相合異基因HSCT的患者CMV感染率分別為39.29%和14.58%，兩者相比較有顯著性差異(P0.05)。0-度急性GVHD組CMV感染的發(fā)生率為19.44 %，而-IV度急性GVHD 組為46.88%，兩者間的差異有顯著意義(P005)。CMV抗原陽性與陰性患者的急性GVHD發(fā)生率有顯著性差異(P005)。結(jié)論： 外周血白細(xì)胞CMV pp65病毒抗原檢測可作為造血干細(xì)胞移植后CMV病的監(jiān)測指標(biāo)，用于指導(dǎo)移植后抗病毒的治療和療效評價。

3、【關(guān)鍵詞】 造血干細(xì)胞移植； 巨細(xì)胞病毒； pp65抗原； 熒光免疫組織化學(xué)測定Survellance of Cytomegalovirus for Antiviral Efficacy and Risk Factors in Allogeneic Hematopoietic Stem Cell TransplantationAbstract    The study was aimed to investigate the pp65 antigen of human cytomegalovirus (CMV) and its clinical sign

4、ificance in patients revived allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). 104 patients received allogeneic HSCT were studied. Anticoagulant blood samples were obtained from the recipients before and after transplantation and in the convalescence. CMV pp65 antigen in leukocytes was dete

5、cted by indirect immunoflurescence assay using CMV Brite Kit weekly. The results showed that among the 104 patients，29 cases were CMV pp65 positive (27.88%). Out of 29 cases 16 were CMV antigenemia and 13 cases were CMV disease. There were 25 cases who positively responded to antiviral therapy (effe

6、ctive ratio 86.21%) and 4 cases died (case-fatality ratio 13.79%). The detection revealed a significant difference in the incidence of CMV infection between the patients received unrelated or haploidentical family donor HSCT (39.29%) and HLA-identical sibling donor HSCT (14.58%) (P<0.05

7、). The incidence rate of CMV infection in patients with 0- grade aGVHD and patients with -IV grade aGVHD were 19.44% and 46.88% respectively，which had significant difference (P0.05)。There was significant difference in the occurance of aGVHD between the patients with and without positive CMV pp65 (P&

8、lt;0.05). It is concluded that infection of CMV can be detected by the CMV pp65 monoclonal fluorescence immunohistochemistry，The detection of CMV pp65 antigen in peripheral blood leukocytes as a indicator for CMV disease survellance after HSCT，which may be used to early diagnose the CMV infection，to

9、 guide the antiviral treatment and evaluate its efficacy.Key words hematopoietic stem cell transplantation; cytomegalovirus; pp65 antigen; fluorescenceimmunohistochemistry assay    異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoie-tic stem cell transplantation，allo-HSCT)后人類巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，C

10、MV)感染是主的感染合并癥及死亡原因1。因此，對allo HSCT后CMV活動性感染進(jìn)行監(jiān)測和防治甚為重。早期診斷、早期治療是預(yù)防移植后CMV病發(fā)生和減少因CMV感染而致死亡的關(guān)鍵措施。外周血白細(xì)胞CMV pp65抗原的檢測是診斷CMV感染的早期、快速和敏感的方法，可以指導(dǎo)移植后預(yù)防性抗CMV治療，監(jiān)測抗病毒治療療效2。本研究采用CMV pp65單克隆抗體免疫熒光測定法和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法，對104例異基因造血干細(xì)胞移植的患者做了連續(xù)性監(jiān)測和分析，以研究移植后抗病毒治療中CMV抗原陽性細(xì)胞數(shù)的變化并探討其在監(jiān)測CMV感染中的意義。 材料和方法病例選擇104例患者均為2004年3月至200

11、5年3月在我院進(jìn)行造血干細(xì)胞移植者，其中男64例，女40例，平均年齡27.2 歲，年齡范圍5-50歲，其臨床特點(diǎn)見附表。預(yù)處理方案和移植物抗宿主病的預(yù)防預(yù)處理方案采用改良馬利蘭/環(huán)磷酰胺(Bu/Cy)方案，個別患者采用環(huán)磷酰胺和全身照射(CTX/TBI)為主的預(yù)處理方案。移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)預(yù)防采用經(jīng)典環(huán)孢菌素A 聯(lián)合短程甲氨蝶呤方案。CMV感染的分類和定義3CMV活動性感染 血中出現(xiàn)CMV pp65抗原陽性白細(xì)胞（診斷標(biāo)準(zhǔn)： CMV pp65陽性細(xì)胞 > 1 / 1×105 WBC4），即出現(xiàn)CMV 抗原血癥，包括無癥

12、狀感染和CMV病。CMV無癥狀感染者 僅CMV pp65抗原血癥陽性，而無臨床表現(xiàn)者。CMV病 CMV pp65抗原血癥出現(xiàn)于7天內(nèi)，若體溫37.8持續(xù)3天以上者并出現(xiàn)下列二項者可診斷為CMV?。?白細(xì)胞計數(shù)3.0×109/L，無其他原因可解釋者；不典型淋巴細(xì)胞增多，異常淋巴細(xì)胞>10%；呼吸困難或間質(zhì)性肺炎(interstitial pneumonia，IP)胸片證實(shí)，而無其他原因者；肝炎(肝功能異常、肝脾腫大)；腹痛、胃腸道出血；視網(wǎng)膜炎；移植物植入不良。Table . Patient characteristics（略）CMV 感染的防治預(yù)防方案 對全部異基因HSCT患者

13、應(yīng)用更昔洛韋(ganciclovir，DHPG) 及大蒜素預(yù)防CMV感染。DHPG劑量為10 mg/（kg·d），于移植前第9天至移植前第2天每天分2次靜脈滴注。大蒜素劑量為1 mg/（kg·d）于移植后1-30天給予靜脈滴注；中晚期給予口服大蒜素。            作者：賈晉松，劉東平，黃曉軍，吳彤，劉代紅，張耀臣，蘇宏，王靜波，周葭蕤，劉強(qiáng)，殷宇明，孫瑞娟，段萱，陸道培【摘】      

14、   本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。治療方案 一旦確診CMV 活動性感染立即給藥。開始為誘導(dǎo)治療，DHPG劑量為10 mg/（kg·d），分2 次靜脈滴注，持續(xù)2-3周。若病情好轉(zhuǎn)則轉(zhuǎn)為維持治療，每日劑量不變，但每周用藥5天，再持續(xù)2-3周，必時亦可適當(dāng)延長。可聯(lián)合靜脈輸注免疫球蛋白500 mg/kg，隔日1次，連續(xù)2 周。若DHPG造成嚴(yán)重白細(xì)胞減低或療效不顯著時則換用膦甲酸鈉 (foscarnet) 120

15、-180 mg/（kg·d)靜脈點(diǎn)滴。對前者，白細(xì)胞上升超過1.5×109/L時可換用DHPG。對重癥者，DHPG與膦甲酸鈉聯(lián)合使用或DHPG、膦甲酸鈉和免疫球蛋白三藥聯(lián)合應(yīng)用。以上治療同時均加用大蒜素1 mg/（kg·d），靜脈滴注。CMV檢測標(biāo)本收集 自預(yù)處理開始每周對患者EDTA抗凝外周血血標(biāo)本進(jìn)行CMV pp65及CMV-PCR動態(tài)檢測，直至出院。試劑 CMV Brite 免疫熒光抗原血癥試劑盒為荷蘭公司產(chǎn)品(購自深圳晶美生物工程有限公司)，CMV抗原陽性和陰性對照玻片由試劑盒提供。CMV pp65熒光免疫組織化學(xué)法檢測 分離白細(xì)胞：取EDTA抗凝血5 m

16、l，采用右旋糖酐（分子量為20萬）沉降法分離白細(xì)胞；調(diào)整細(xì)胞濃度：用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×106/ml；制備細(xì)胞涂片；固定和破膜；免疫熒光染色：加抗pp65混合單克隆抗體(C10/C11，1100稀釋)，PBS洗滌晾干后加入 FITC標(biāo)記的羊抗小鼠Ig，置于濕盒中，37溫育30分鐘，PBS洗滌后鏡檢；讀片和結(jié)果判斷：用熒光顯微鏡觀察結(jié)果，在鏡下觀察全部細(xì)胞，pp65陽性細(xì)胞呈均勻的綠色/黃綠色，圓形/多葉的核染色（圖1）。CMV-PCR 檢測 采用華美生物工程公司生產(chǎn)的40 PCR檢測試劑盒檢測血漿及尿的CMV-DNA。樣本的采集：取靜脈血1 ml

17、，EDTA抗凝，離心制備血漿。同時取晨尿5 ml，離心取沉渣。統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，CMV感染的累計發(fā)生率用Kaplan-Meier曲線表示，曲線間的比較用log-rank檢驗（曲線無交叉）或Breslow檢驗（曲線交叉）；多因素分析用Cox回歸分析。組間CMV感染率分析采用2 檢驗。以P=005為檢驗水準(zhǔn)，P<005為差異顯著。結(jié)果CMV感染發(fā)病情況104例患者造血干細(xì)胞移植術(shù)后發(fā)生活動性CMV感染者共29例，發(fā)生率27.88%。本組病例中一部分為同時采用CMV pp65熒光免疫組織化學(xué)法及PCR法檢測，前者的陽性率為26.81%（26/97）

18、，后者的陽性率為34.38%（11/32），兩者的符合率為86.21%。29例CMV感染者中單純CMV血癥16例，占總感染人數(shù)的55.17 %；出血性膀胱炎6例，占20.69 %；間質(zhì)性肺炎4例，占13.79 %；CMV腸炎3例，占10.34 %。HSCT后發(fā)生巨細(xì)胞病毒感染的時間在2-4個月，且移植后第30至70天為CMV感染的高峰期，其中50天出現(xiàn)陽性者15例，占51.72% (附表、圖2)。CMV感染與移植方式的關(guān)系CMV感染患者中，非血緣及單倍體相合異基因HSCT患者（22例，皆使用ATG）與同胞HLA相合異基因HSCT患者（7例，未使用ATG）的CMV感染率分別為39.29%和14.

19、58%，兩者相比較有顯著性差異(P0.05)。而單倍體相合異基因HSCT的患者與非血緣異基因HSCT患者CMV感染率分別為4043%和37.50%，兩者相比較無明顯差異(P005)。骨髓造血干細(xì)胞移植、外周血干細(xì)胞移植和骨髓加外周血干細(xì)胞移植的CMV感染發(fā)生率分別為11.11%、26.09%和30.56%，三者之間相比較無顯著性差異 (P0.05)。CMV感染與移植物抗宿主病(GVHD)的關(guān)系29例CMV pp65抗原陽性患者中有23例發(fā)生GVHD (79.31%)，而75例抗原陰性者僅6例發(fā)生GVHD (8%)，抗原陽性與陰性患者的GVHD發(fā)生率有顯著性差異 (P0.05)。0-度急性GVH

20、D組CMV感染的發(fā)生率為19.44 %，而-IV度急性GVHD 組為46.88%，兩者間的差異有顯著性(P0.05) (圖3)。CMV感染治療情況CMV感染患者在應(yīng)用大蒜素基礎(chǔ)上，根據(jù)病情19例接受更昔洛韋加丙種球蛋白治療，18例患者經(jīng)治療后抗原血癥轉(zhuǎn)陰，同時癥狀消失，1例因治療無效合并細(xì)菌和真菌感染而死亡，有效率為94.74%；膦甲酸鈉治療5例，有效4例 (80%)；DHPG 膦甲酸鈉治療5例，有效3例 (60%)；三者之間比較可能由于病例較少未見明差異 (P0.05)。CMV活動性感染患者抗病毒藥物治療的總有效率為8621%（25/29）。16例病毒血癥15例轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰率為93.75%；4

21、例間質(zhì)性肺炎中1例治愈；3例CMV 腸炎中2例痊愈；6例出血性膀胱炎中治療全部有效。CMV感染的相關(guān)危險因素104例患者中死亡13例，CMV感染致死占死亡原因的首位，為所有死亡的30.77% (4例)。非血緣及單倍體相合供者、應(yīng)用抗淋巴細(xì)胞球蛋白（ATG）、 -度急性移植物抗宿主?。℅VHD）是CMV 感染的相關(guān)危險因素，其他因素如年齡、性別、疾病種類、移植前CMV 感染狀態(tài)、預(yù)處理方案與CMV 感染均無顯著相關(guān)性。討論患者在異基因造血干細(xì)胞移植后由于免疫功能缺陷，CMV特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞和輔助T細(xì)胞反應(yīng)缺乏，不能清除感染和產(chǎn)生免疫保護(hù)，致使體內(nèi)潛伏病毒復(fù)燃或經(jīng)輸血或供者細(xì)胞感染CMV病毒，因

22、此容易發(fā)生CMV活動性感染 4。早期檢測CMV對指導(dǎo)臨床治療、提高移植后長期生存率有重意義。CMV pp65是在病毒復(fù)制早期出現(xiàn)的抗原，在抗原陽性的多形核細(xì)胞中含量豐富。因此，外周血白細(xì)胞感染的CMV pp65抗原檢測是一種診斷和監(jiān)測器官和骨髓移植病人CMV活動性感染的強(qiáng)有力的工具。與病毒分離比較，通過檢測CMV pp 65抗原血癥來判斷體內(nèi)有無活動性CMV感染的敏感性和特異性均在95%以上5。CMV有著廣泛的嗜細(xì)胞性，特別是血管內(nèi)皮細(xì)胞、外周血中的白細(xì)胞等極易受到其侵襲，在活動性CMV感染時，外周血中的白細(xì)胞以主動或被動的方式從血管內(nèi)皮細(xì)胞等獲取大量的病毒抗原，因此只能在外周血中檢出含有CM

23、V pp65抗原的白細(xì)胞，即可診斷為活動性CMV感染，而且敏感性和特異性高。不僅如此，CMV pp65陽性白細(xì)胞的數(shù)目還可以反映受者體內(nèi)病毒的負(fù)荷，能體現(xiàn)CMV感染的嚴(yán)重程度、抗病毒治療效果以及感染的預(yù)后。本研究顯示，檢測CMV pp65抗原血癥與血漿CMV-PCR的結(jié)果基本一致。因此，在移植后監(jiān)測CMV pp65抗原，完全可以作為活動性CMV感染的診斷指標(biāo)。目前，抗CMV病的重點(diǎn)是預(yù)防性抗病毒治療，搶先（preemptive）治療是指檢測到CMV亞臨床感染的證據(jù)或針對CMV感染高危者進(jìn)行的抗病毒治療。而早期檢測到活動性CMV感染是搶先治療的先決條件。   

24、60;        作者：賈晉松，劉東平，黃曉軍，吳彤，劉代紅，張耀臣，蘇宏，王靜波，周葭蕤，劉強(qiáng)，殷宇明，孫瑞娟，段萱，陸道培【摘】         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。    CMV感染及其所致的間質(zhì)性肺炎是導(dǎo)致移植后患者死亡的

25、重原因之一。近年來，隨著早期診斷和防治方法的進(jìn)步，CMV感染的預(yù)后已顯著改善?？共《舅幬锶鏒HPG、膦甲酸鈉、西多福韋(cidofovir)的臨床應(yīng)用，使得移植后患者CMV病發(fā)病率和死亡率顯著下降6-8。Reusser等6報道，在EBMT (歐洲外周血與骨髓移植協(xié)作組) 進(jìn)行的DHPG和膦甲酸鈉治療移植患者CMV感染的隨機(jī)對照研究中，DHPG與膦甲酸鈉的療效無顯著差異。本研究中兩組病例雖較少，但結(jié)果與之相似，DHPG與膦甲酸鈉治療的有效率無明顯差異。DHPG與膦甲酸鈉聯(lián)合使用可更有效地治療高負(fù)荷病毒感染的患者 9，西多福韋一般是DHPG與膦甲酸鈉治療失敗時的二線用藥10。大蒜素具有抗CMV作用

26、，陸道培等11在國內(nèi)外首先證實(shí)大蒜中有抗巨細(xì)胞病毒成分，并首先用于防治造血干細(xì)胞移植后間質(zhì)性肺炎。本研究中的病例在應(yīng)用大蒜素基礎(chǔ)上使用更昔洛韋等防治CMV感染亦取得了較好的效果。    104例移植受者中29例發(fā)生CMV感染，DHPG加丙種球蛋白早期干預(yù)性治療16例，15例病毒血癥轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰率為93.75%，僅1例發(fā)展至CMV病。對確診的CMV-IP，大劑量免疫球蛋白 ( 500 mg / kg，隔日1次)能夠增強(qiáng)抗病毒治療的效果，而且開始治療時間早、初始用量大，待癥狀有明顯改善后才可逐步減量，這樣可使間質(zhì)性肺炎的病死率明顯降低12。根據(jù)本研究資料，對C

27、MV陽性而無臨床癥狀者進(jìn)行干預(yù)性治療可使CMV轉(zhuǎn)陰，減少CMV病的發(fā)生，有效地降低死亡率。對于伴有嚴(yán)重GVHD、在常規(guī)預(yù)防GVHD的基礎(chǔ)上加用其它免疫抑制劑以及大量輸血的患者，采用干預(yù)性治療盡快使CMV血癥轉(zhuǎn)陰的必性更大。    本研究資料為首次報告有關(guān)單倍體相合異基因HSCT患者CMV的感染情況，非血緣及單倍體相合異基因HSCT患者與同胞HLA相合異基因HSCT患者CMV感染率有顯著性差異，因此ATG很可能是發(fā)生CMV感染的一個重危險因素。ATG是異基因造血干細(xì)胞移植應(yīng)用的重的免疫抑制劑，非血緣及配型不相合的患者在移植過程中均需使用ATG。但ATG的體

28、內(nèi)去T細(xì)胞作用使受者免疫功能在移植過程中更為低下，免疫恢復(fù)的時間更長，CD4 T細(xì)胞數(shù)量減少，因而更易發(fā)生CMV感染13。    GVHD與CMV感染關(guān)系復(fù)雜，急性GVHD增加了發(fā)生CMV病的危險，是影響CMV感染發(fā)生的重因素8。GVHD越嚴(yán)重，CMV感染的機(jī)率越大。Meyers等14報道，造血干細(xì)胞移植后0-度GVHD的患者CMV感染率為42.1%，-度GVHD 患者感染率為63.1%。本研究結(jié)果與其相似，急性GVHD可明顯增加CMV感染的發(fā)生率，且隨著GVHD的程度加重感染率有所增高?；颊甙l(fā)生GVHD后大量應(yīng)用免疫抑制劑可進(jìn)一步減弱HSCT患者尚未恢

29、復(fù)的免疫力，另外GVHD本身也能夠明顯地減弱患者的免疫功能，進(jìn)而導(dǎo)致CMV的激活。因此有效地預(yù)防GVHD可以減少CMV感染的發(fā)生，在治療上必須同時兼顧二者。    CMV活動性感染是造血干細(xì)胞移植患者的重并發(fā)癥和首位死亡的原因。隨著檢測手段的不斷進(jìn)步，如CMV-PCR、CMV pp65單克隆抗體熒光免疫組織化學(xué)法、NASBA（the nucleic acid sequence-based assay）等項目開展使得更為準(zhǔn)確地檢測CMV和早期診斷CMV感染成為可能。CMV pp65抗原檢測在指導(dǎo)預(yù)防性抗病毒治療方面起到重作用8。本研究提示，人類CMV pp

30、65白細(xì)胞病毒抗原檢測，即CMV pp65陽性可作為造血干細(xì)胞移植并發(fā)CMV病的診斷依據(jù)，它有助于早期、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)CMV感染，為早期治療提供依據(jù)，指導(dǎo)移植后的抗病毒治療及療效評價?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Stephen AL，Thompson CH，Tattersall MH，et al. Analysis of mutations in the URR and E6/E7 oncogenes of HPV 16 cervical cancer isolates from central China. Int J Cancer，2000; 86:695-7012 Mori T，Okamoto S，Ma

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38、;      本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。11 陸道培，主編： 白血病治療學(xué). 北京：科學(xué)出版社，1994：302-30312 Sokos DR，Berger M，Lazarus HM. Intravenous immunoglobulin: appropriate indications and uses in hematopoietic stem cell transplantatio

39、n. Biol Blood Marrow Transplant，2002; 8:117-13013 Maecker HT，Maino VC. Analyzing T-cell responses to cytomegalovirus by cytokine flow cytometry. Hum Immunol，2004; 65:493-49914 Meyers JD，F(xiàn)lournoy N，Thomas ED. Risk factors for cytomegalo-virus infection after human bone marrow transplantation. J Infec

40、t Dis，1986; 153: 478-488.    【摘】 本研究探討異基因造血干細(xì)胞移植(allo HSCT)后受者外周血白細(xì)胞巨細(xì)胞病毒(CMV) pp65抗原陽性細(xì)胞數(shù)的變化及臨床意義。以104例HSCT受者為研究對象，采集移植前后及恢復(fù)期受者的抗凝血標(biāo)本，用CMV pp65單克隆抗體熒光免疫組織化學(xué)法檢測CMV早期抗原，并進(jìn)行動態(tài)觀察。結(jié)果表明： 104例HSCT受者中29例移植后檢出CMV pp65抗原陽性，檢出率27.88%，其中16例為CMV血癥，13例為CMV病。29例經(jīng)抗病毒治療后25例抗原轉(zhuǎn)為陰性，有效率86.21%，死亡4例，

41、病死率13.79%。CMV感染患者中，受非血緣或單倍體相合異基因HSCT的患者與受同胞全相合異基因HSCT的患者CMV感染率分別為39.29%和14.58%，兩者相比較有顯著性差異(P0.05)。0-度急性GVHD組CMV感染的發(fā)生率為19.44 %，而-IV度急性GVHD 組為46.88%，兩者間的差異有顯著意義(P005)。CMV抗原陽性與陰性患者的急性GVHD發(fā)生率有顯著性差異(P005)。結(jié)論： 外周血白細(xì)胞CMV pp65病毒抗原檢測可作為造血干細(xì)胞移植后CMV病的監(jiān)測指標(biāo)，用于指導(dǎo)移植后抗病毒的治療和療效評價。 【關(guān)鍵詞】 造血干細(xì)胞移植； 巨細(xì)胞病毒； pp65抗原； 熒光免疫組

42、織化學(xué)測定Survellance of Cytomegalovirus for Antiviral Efficacy and Risk Factors in Allogeneic Hematopoietic Stem Cell TransplantationJIA Jin-Song，LIU Dong-Ping，HUANG Xiao-Jun，WU Tong，LIU Dai-Hong，ZHANG Yao-Chen，SU Hong，WANG Jing-Bo，ZHOU Jia-Rui，LIU Qiang，YING Min-Yu，SUN Rui-Juan，DUAN Xuan， LU Dao-PeiBei

43、jing Daopei Hospital，Beijing 100039，ChinaAbstract    The study was aimed to investigate the pp65 antigen of human cytomegalovirus (CMV) and its clinical significance in patients revived allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). 104 patients received allogeneic HS

44、CT were studied. Anticoagulant blood samples were obtained from the recipients before and after transplantation and in the convalescence. CMV pp65 antigen in leukocytes was detected by indirect immunoflurescence assay using CMV Brite Kit weekly. The results showed that among the 104 patients，29 case

45、s were CMV pp65 positive (27.88%). Out of 29 cases 16 were CMV antigenemia and 13 cases were CMV disease. There were 25 cases who positively responded to antiviral therapy (effective ratio 86.21%) and 4 cases died (case-fatality ratio 13.79%). The detection revealed a significant difference in the i

46、ncidence of CMV infection between the patients received unrelated or haploidentical family donor HSCT (39.29%) and HLA-identical sibling donor HSCT (14.58%) (P<0.05). The incidence rate of CMV infection in patients with 0- grade aGVHD and patients with -IV grade aGVHD were 19.44% and 46

47、.88% respectively，which had significant difference (P0.05)。There was significant difference in the occurance of aGVHD between the patients with and without positive CMV pp65 (P<0.05). It is concluded that infection of CMV can be detected by the CMV pp65 monoclonal fluorescence immunohistochemistr

48、y，The detection of CMV pp65 antigen in peripheral blood leukocytes as a indicator for CMV disease survellance after HSCT，which may be used to early diagnose the CMV infection，to guide the antiviral treatment and evaluate its efficacy.Key words hematopoietic stem cell transplantation; cytomegalovirus

49、; pp65 antigen; fluorescenceimmunohistochemistry assay    異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoie-tic stem cell transplantation，allo-HSCT)后人類巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)感染是主的感染合并癥及死亡原因1。因此，對allo HSCT后CMV活動性感染進(jìn)行監(jiān)測和防治甚為重。早期診斷、早期治療是預(yù)防移植后CMV病發(fā)生和減少因CMV感染而致死亡的關(guān)鍵措施。外周血白細(xì)胞CMV pp65抗原的檢測是診斷CMV感染的早期

50、、快速和敏感的方法，可以指導(dǎo)移植后預(yù)防性抗CMV治療，監(jiān)測抗病毒治療療效2。本研究采用CMV pp65單克隆抗體免疫熒光測定法和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法，對104例異基因造血干細(xì)胞移植的患者做了連續(xù)性監(jiān)測和分析，以研究移植后抗病毒治療中CMV抗原陽性細(xì)胞數(shù)的變化并探討其在監(jiān)測CMV感染中的意義。 材料和方法病例選擇104例患者均為2004年3月至2005年3月在我院進(jìn)行造血干細(xì)胞移植者，其中男64例，女40例，平均年齡27.2 歲，年齡范圍5-50歲，其臨床特點(diǎn)見附表。預(yù)處理方案和移植物抗宿主病的預(yù)防預(yù)處理方案采用改良馬利蘭/環(huán)磷酰胺(Bu/Cy)方案，個別患者采用環(huán)磷酰胺和全身照射(CTX/

51、TBI)為主的預(yù)處理方案。移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)預(yù)防采用經(jīng)典環(huán)孢菌素A 聯(lián)合短程甲氨蝶呤方案。CMV感染的分類和定義3CMV活動性感染 血中出現(xiàn)CMV pp65抗原陽性白細(xì)胞（診斷標(biāo)準(zhǔn)： CMV pp65陽性細(xì)胞 > 1 / 1×105 WBC4），即出現(xiàn)CMV 抗原血癥，包括無癥狀感染和CMV病。CMV無癥狀感染者            作者：賈晉松，劉東平，黃曉軍，吳彤，劉代紅，張耀臣，蘇宏，王靜波，

52、周葭蕤，劉強(qiáng)，殷宇明，孫瑞娟，段萱，陸道培【摘】         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。僅CMV pp65抗原血癥陽性，而無臨床表現(xiàn)者。CMV病 CMV pp65抗原血癥出現(xiàn)于7天內(nèi)，若體溫37.8持續(xù)3天以上者并出現(xiàn)下列二項者可診斷為CMV?。?白細(xì)胞計數(shù)3.0×109/L，無其他原因可解釋者；不典型淋巴細(xì)胞增多，異常淋巴細(xì)胞>10%；

53、呼吸困難或間質(zhì)性肺炎(interstitial pneumonia，IP)胸片證實(shí)，而無其他原因者；肝炎(肝功能異常、肝脾腫大)；腹痛、胃腸道出血；視網(wǎng)膜炎；移植物植入不良。Table . Patient characteristics（略）CMV 感染的防治預(yù)防方案 對全部異基因HSCT患者應(yīng)用更昔洛韋(ganciclovir，DHPG) 及大蒜素預(yù)防CMV感染。DHPG劑量為10 mg/（kg·d），于移植前第9天至移植前第2天每天分2次靜脈滴注。大蒜素劑量為1 mg/（kg·d）于移植后1-30天給予靜脈滴注；中晚期給予口服大蒜素。治療方案 一旦確診CMV 活動性感染

54、立即給藥。開始為誘導(dǎo)治療，DHPG劑量為10 mg/（kg·d），分2 次靜脈滴注，持續(xù)2-3周。若病情好轉(zhuǎn)則轉(zhuǎn)為維持治療，每日劑量不變，但每周用藥5天，再持續(xù)2-3周，必時亦可適當(dāng)延長?？陕?lián)合靜脈輸注免疫球蛋白500 mg/kg，隔日1次，連續(xù)2 周。若DHPG造成嚴(yán)重白細(xì)胞減低或療效不顯著時則換用膦甲酸鈉 (foscarnet) 120-180 mg/（kg·d)靜脈點(diǎn)滴。對前者，白細(xì)胞上升超過1.5×109/L時可換用DHPG。對重癥者，DHPG與膦甲酸鈉聯(lián)合使用或DHPG、膦甲酸鈉和免疫球蛋白三藥聯(lián)合應(yīng)用。以上治療同時均加用大蒜素1 mg/（kg·

55、;d），靜脈滴注。CMV檢測標(biāo)本收集 自預(yù)處理開始每周對患者EDTA抗凝外周血血標(biāo)本進(jìn)行CMV pp65及CMV-PCR動態(tài)檢測，直至出院。試劑 CMV Brite 免疫熒光抗原血癥試劑盒為荷蘭公司產(chǎn)品(購自深圳晶美生物工程有限公司)，CMV抗原陽性和陰性對照玻片由試劑盒提供。CMV pp65熒光免疫組織化學(xué)法檢測 分離白細(xì)胞：取EDTA抗凝血5 ml，采用右旋糖酐（分子量為20萬）沉降法分離白細(xì)胞；調(diào)整細(xì)胞濃度：用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×106/ml；制備細(xì)胞涂片；固定和破膜；免疫熒光染色：加抗pp65混合單克隆抗體(C10/C11，1100稀釋)

56、，PBS洗滌晾干后加入 FITC標(biāo)記的羊抗小鼠Ig，置于濕盒中，37溫育30分鐘，PBS洗滌后鏡檢；讀片和結(jié)果判斷：用熒光顯微鏡觀察結(jié)果，在鏡下觀察全部細(xì)胞，pp65陽性細(xì)胞呈均勻的綠色/黃綠色，圓形/多葉的核染色（圖1）。CMV-PCR 檢測 采用華美生物工程公司生產(chǎn)的40 PCR檢測試劑盒檢測血漿及尿的CMV-DNA。樣本的采集：取靜脈血1 ml，EDTA抗凝，離心制備血漿。同時取晨尿5 ml，離心取沉渣。統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，CMV感染的累計發(fā)生率用Kaplan-Meier曲線表示，曲線間的比較用log-rank檢驗（曲線無交叉）或Breslow

57、檢驗（曲線交叉）；多因素分析用Cox回歸分析。組間CMV感染率分析采用2 檢驗。以P=005為檢驗水準(zhǔn)，P<005為差異顯著。結(jié)果CMV感染發(fā)病情況104例患者造血干細(xì)胞移植術(shù)后發(fā)生活動性CMV感染者共29例，發(fā)生率27.88%。本組病例中一部分為同時采用CMV pp65熒光免疫組織化學(xué)法及PCR法檢測，前者的陽性率為26.81%（26/97），后者的陽性率為34.38%（11/32），兩者的符合率為86.21%。29例CMV感染者中單純CMV血癥16例，占總感染人數(shù)的55.17 %；出血性膀胱炎6例，占20.69 %；間質(zhì)性肺炎4例，占13.79 %；CMV腸炎3例，占10.34 %。

58、HSCT后發(fā)生巨細(xì)胞病毒感染的時間在2-4個月，且移植后第30至70天為CMV感染的高峰期，其中50天出現(xiàn)陽性者15例，占51.72% (附表、圖2)。CMV感染與移植方式的關(guān)系CMV感染患者中，非血緣及單倍體相合異基因HSCT患者（22例，皆使用ATG）與同胞HLA相合異基因HSCT患者（7例，未使用ATG）的CMV感染率分別為39.29%和14.58%，兩者相比較有顯著性差異(P0.05)。而單倍體相合異基因HSCT的患者與非血緣異基因HSCT患者CMV感染率分別為4043%和37.50%，兩者相比較無明顯差異(P005)。骨髓造血干細(xì)胞移植、外周血干細(xì)胞移植和骨髓加外周血干細(xì)胞移植的CM

59、V感染發(fā)生率分別為11.11%、26.09%和30.56%，三者之間相比較無顯著性差異 (P0.05)。CMV感染與移植物抗宿主病(GVHD)的關(guān)系29例CMV pp65抗原陽性患者中有23例發(fā)生GVHD (79.31%)，而75例抗原陰性者僅6例發(fā)生GVHD (8%)，抗原陽性與陰性患者的GVHD發(fā)生率有顯著性差異 (P0.05)。0-度急性GVHD組CMV感染的發(fā)生率為19.44 %，而-IV度急性GVHD 組為46.88%，兩者間的差異有顯著性(P0.05) (圖3)。CMV感染治療情況CMV感染患者在應(yīng)用大蒜素基礎(chǔ)上，根據(jù)病情19例接受更昔洛韋加丙種球蛋白治療，18例患者經(jīng)治療后抗原血

60、癥轉(zhuǎn)陰，同時癥狀消失，1例因治療無效合并細(xì)菌和真菌感染而死亡，有效率為94.74%；膦甲酸鈉治療5例，有效4例 (80%)；DHPG 膦甲酸鈉治療5例，有效3例 (60%)；三者之間比較可能由于病例較少未見明差異 (P0.05)。CMV活動性感染患者抗病毒藥物治療的總有效率為8621%（25/29）。16例病毒血癥15例轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰率為93.75%；4例間質(zhì)性肺炎中1例治愈；3例CMV 腸炎中2例痊愈；6例出血性膀胱炎中治療全部有效。CMV感染的相關(guān)危險因素104例患者中死亡13例，CMV感染致死占死亡原因的首位，為所有死亡的30.77% (4例)。非血緣及單倍體相合供者、應(yīng)用抗淋巴細(xì)胞球蛋白（ATG）、 -度急性移植物抗宿主?。℅VHD）是CMV 感染的相關(guān)危險因素，其他因素如年齡、性別、疾病種類、移植前CMV 感染狀態(tài)、預(yù)處理方案與CMV 感染均無顯著相關(guān)性。討論患者在異基因造血干細(xì)胞移植后由于免疫功能缺陷，CMV特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞和輔助T細(xì)胞反應(yīng)缺乏，不能清除感染和產(chǎn)生免疫保護(hù)，致使體內(nèi)潛伏病毒復(fù)燃或經(jīng)輸血或供者細(xì)胞感染CMV病毒，因此容易發(fā)生CMV活動性感染 4。早期檢