建立FQPCR定量體系檢測新型隱球菌CAP10 mRNA

1、建立FQPCR定量體系檢測新型隱球菌CAP10 mRNA                        作者：戴琳孫， 林旎， 陳勇， 江凌程祖建， 歐啟水    【摘要】  目的 建立熒光定量PCR（FQPCR）技術(shù)定量檢測新型隱球菌（CN）的莢膜相關(guān)蛋白10（CAP10）基因mRNA，為新型隱球菌的診斷、

2、預(yù)后及療效判斷提供依據(jù)。 方法 用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法從CN標準株（ATCC34874）中擴增得到CAP10，構(gòu)建重組質(zhì)粒標準品pGEMTEasyCAP10，以倍比稀釋的標準品制備標準曲線。設(shè)計引物和探針，建立FQPCR反應(yīng)體系并對其重復(fù)性、特異性和線性范圍進行評價。 結(jié)果 成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒標準品pGEMTEasyCAP10，并用倍比稀釋的標準品制備了標準曲線Y=-3.11X+38.84。批內(nèi)重復(fù)性試驗CV值為0.31%，批間重復(fù)性試驗CV值為2.73%。FQPCR體系能特異擴增新型隱球菌，特異性好，該體系的線性范圍為101copies/L108 copies/L。 結(jié)論 成功建立CN的CAP

3、10 mRNA的定量檢測方法；該方法重復(fù)性好，特異性強。     【關(guān)鍵詞】  細胞莢膜； 隱球菌，新型； 真菌蛋白質(zhì)類； 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)； mRNA，信使    新型隱球菌（cryptococcus neoformans，CN）的莢膜相關(guān)蛋白10（capsule associated protein 10，CAP10）對莢膜的形成是必不可少的，它在毒力的形成和維持中起至關(guān)重要作用12。傳統(tǒng)的實驗診斷項目，如腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）隱球菌計數(shù)、抗原測定和培養(yǎng)等手段靈敏度

4、低、耗時長，無法準確評估CN的毒力和活力3。本研究擬建立實時熒光定量PCR（realtime fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)QPCR）技術(shù)檢測CN的CAP10基因mRNA，既可為CN的診斷，尤其是毒力和活力的判斷提供敏感、特異的定量手段，又可為治療CN的效果和預(yù)后判斷提供依據(jù)。        1  材料與方法        1.1  材料  CN標準菌株（ATCC34874）購自上海第二軍醫(yī)大學附

5、屬長征醫(yī)院皮膚病學研究所；結(jié)核桿菌由福州市肺科醫(yī)院提供，腦膜炎雙球菌和金黃色葡萄球菌由本室分離保存；RNA提取Trizol試劑自（美國invitrogen公司）；Reverse Transcription System、Taq DNA聚合酶、緩沖液、dNTP及pGEMTEasy Vecto購自（美國Promega公司）；DNA純化回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒和真菌裂解液及溶壁酶自（北京天根生化科技公司）。        1.2  RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)  取CN標準株及CSF標本離心沉淀物，加入溶壁酶

6、20 L混勻后37 水浴30 min破壁，離心棄上清，按Trizol RNA提取試劑盒說明書操作抽提RNA。取上述總RNA按試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，被逆轉(zhuǎn)錄的為CN的mRNA。        1.3  引物與探針的設(shè)計與合成  比對CN 5種血清型（A、B、C、D、AD）CAP10基因，尋找同源序列，用Primer 5設(shè)計CAP10特異性引物和探針（53）：        上游：CCAAGCCCCCAAACCTCCCATACA

7、0;       下游：AACGCGTACCATTCATCAAAGCCC        TaqMan探針：CCTCTTCTTGTACTCAGCAACGGC        TTCGGGCAA        探針5'端由FAM標記，3'端由TRAMA標記。引物及探針均由美國invitrogen公司合成并純化，目的片段

8、大小為175 bp。        1.4  標準品的制備  （1）目的DNA片段的制備：PCR反應(yīng)體系含Mg2（25 mmol/L）3 L，10×buffer 2.5 L，dNTP（10 mmol/L）0.5 L，上下游引物（25 mol/L）各0.25 L，Taq聚合酶（5 U/L）0.3 L，DNA模板3 L，加滅菌純水至總體積為25 L。反應(yīng)條件為94 5 min，94 45 s56 45 s72 45 s，35循環(huán)，72 延伸7 min。1.5瓊脂糖凝膠電泳(電壓6080 V，電流強度

9、2030 mA)，檢測PCR產(chǎn)物。（2）載體的構(gòu)建、鑒定和拷貝數(shù)的換算：采用膠回收試劑盒純化回收切下的瓊脂糖凝膠上的目的片段，目的片段與質(zhì)粒pGEM T連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5中, 37 過夜培養(yǎng)，篩選出重組體，提取質(zhì)粒，擴增，根據(jù)電泳結(jié)果，重新將重組體培養(yǎng)至LB培養(yǎng)基，37 搖床過夜，純化質(zhì)粒，送上海生工公司測序，測吸光度(D)值,根據(jù)阿佛加德羅常數(shù)(6.023×1023 分子數(shù)/摩爾)換算為分子拷貝數(shù)。        1.5  FQPCR反應(yīng)體系的建立  （1）標準曲線的制備：利

10、用ABI7000 Sequence Detector儀器在最優(yōu)化的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件下，將插有目的DNA的質(zhì)粒10倍倍比稀釋成107，106，105，104，103拷貝數(shù)/微升，用作定量標準品制備標準曲線，以此定量未知模板的濃度。（2）FQPCR反應(yīng)及條件：25 L體系中包括Mg2（25 mmol/L）3.5 L，10×buffer 2.5 L，dNTP（10 mmol/L）0.5 L，上下游引物（25 mol/L）各0.25 L，Taq聚合酶（5 U/L）0.3 L，熒光探針0.3 L和1 L倍比稀釋的陽性質(zhì)粒標準品。反應(yīng)條件：94 5 min，94 45 s56 45 s，35個

11、循環(huán)。儀器根據(jù)陽性質(zhì)粒標準品自動繪制標準曲線，并得出樣品檢測結(jié)果。        1.6  方法學評價  (1)重復(fù)性試驗：包括批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗。以提取的質(zhì)粒DNA為模板進行重復(fù)性檢測，批內(nèi)重復(fù)性試驗是對同一模板同時進行6次重復(fù)測定，批間重復(fù)性試驗是連續(xù)6 d對同一樣本進行重復(fù)測定。(2)特異性試驗：分別取臨床上常見的腦膜炎病原體含結(jié)核桿菌、腦膜炎雙球菌、金黃色葡萄球菌各一份按標準品目的基因片段的方法制備cDNA作為模板，判斷擴增反應(yīng)特異性。(3)線性范圍測定：將定量標準品用ddH2O進行10倍倍比稀

12、釋，以此作為模板進行FQPCR，得到標準曲線，通過對每一濃度標準品的熒光曲線形狀和各濃度熒光曲線的相關(guān)性大小，確定檢測線性范圍。    2  結(jié)  果        2.1  重組質(zhì)粒的鑒定  重組質(zhì)粒中插入的CAP10基因片段進行測序并與BLAST比對，結(jié)果顯示被測基因片段序列與GenBank報道的完全一致。結(jié)果提示，獲得了正確的目的基因，同時成功構(gòu)建pGEMTEasyCAP10重組質(zhì)粒(圖1)。     

13、;   2.2  重組質(zhì)粒的定量  提取的質(zhì)粒測其D值，D=0.073，D260=0.068，D260/D280=1.6，計算得質(zhì)粒DNA濃度為5.0×1012拷貝數(shù)/微升。        2.3  標準曲線  (1)將重組質(zhì)粒模板依次稀釋成107、106、105、104、103拷貝數(shù)/微升濃度梯度，在ABI7000擴增儀上進行擴增反應(yīng)，得到重組質(zhì)粒pGEMTEasyCAP10標準品的定量標準曲線Y=-3.11X+38.84（如圖2），不同濃度模板拷貝數(shù)與

14、Ct值之間有很好的線性關(guān)系（r=0.998）。(2)重組質(zhì)粒pGEMTEasyCAP10標準品的擴增曲線，如圖3。橫坐標為Ct值，縱坐標為拷貝數(shù).        2.4  方法學評價        2.4.1  重復(fù)性試驗  （1）批內(nèi)重復(fù)性試驗：對同一模板同時進行6次重復(fù)測定，測得Ct值為22.27，22.37，22.22，22.23，22.17，22.20，平均Ct值為22.24，批內(nèi)CV值為0.31%（圖4）。（2）批間

15、重復(fù)性試驗：連續(xù)6 d對同一樣本進行定量PCR檢測，測得的Ct值為18.5，18.7，19.8，18.8，19.6，19.0，平均Ct值為19.1，批間CV值為2.73%?？梢姳緦嶒灅?gòu)建的實時熒光定量PCR檢測方法具有良好的重復(fù)性。        2.4.2  特異性試驗  FQPCR檢測結(jié)果，新型隱球菌標準品有熒光曲線增長，而其余孔無熒光曲線增長(圖5)。表明該方法具有良好的特異性。        2.4.3  線性范圍測定

16、  當標準品濃度>108 拷貝數(shù)/微升時，擴增曲線不呈典型“S”形，且標準曲線相關(guān)性不好，當標準品濃度<101拷貝數(shù)/微升時，擴增曲線也不典型，有時因濃度太低甚至無擴增曲線。而在此范圍間，擴增曲線均呈典型“S”形，故認為建立的CAP10基因的FQPCR系統(tǒng)的檢測線性范圍為101108  拷貝數(shù)/微升(圖6)。    橫坐標為擴增循環(huán)數(shù)，縱坐標為熒光強度.  藍色、紅色、綠色、紫色分別為新型隱球菌、結(jié)核桿菌、腦膜炎雙球菌、金黃色葡萄球菌.        3

17、  討  論        目前CN的實驗室診斷主要依據(jù)CSF印度墨汁染色、培養(yǎng)及CN抗原測定等，這些方法的陽性率不高、耗時長、無法準確判斷CN的活力和毒力。一些文獻報道，用PCR法檢測CN，但針對的靶基因不是毒力相關(guān)基因4。長期困擾臨床醫(yī)師的問題是，有的病人CN數(shù)目不多，可是其臨床癥狀嚴重，有的病人CN數(shù)量很多，臨床癥狀卻較輕。另外CN的數(shù)量和病情的轉(zhuǎn)歸之間缺乏相關(guān)性，使得醫(yī)師無法判斷療效和預(yù)后。        本實驗以毒力相關(guān)因子C

18、AP10為研究對象，建立FQPCR定量檢測CN的CAP10 mRNA，可提升CN的診斷靈敏度。由于直接檢測決定致病性的隱球菌的毒力，可為療效觀察、預(yù)后判斷及病情轉(zhuǎn)歸的預(yù)測提供幫助。此外，實驗表明，相對于DNA，已死亡致病菌mRNA不穩(wěn)定，直接檢測致病菌的mRNA能夠真實地反應(yīng)其活力狀態(tài)。mRNA檢測不但可以反應(yīng)感染局部致病菌的有無還可以判斷致病菌的存活狀態(tài)56。        本實驗將FQPCR法應(yīng)用于CN莢膜基因CAP10的檢測，所建立的定量檢測體系有如下特點：（1）特異性強，其他細菌和真菌不對FQPCR反應(yīng)產(chǎn)生干擾；（2

19、）重復(fù)性好，批內(nèi)重復(fù)實驗及批間重復(fù)實驗變異系數(shù)均<3%；（3）靈敏度高，該檢測體系線性范圍為101108拷貝數(shù)/微升，能滿足CAP10定量檢測需要；（4）操作簡便、易行。本實驗所使用的Taqman探針是目前常用的熒光探針之一，國內(nèi)很多生物工程公司都能合成，且整個實驗過程包括抽提RNA、PCR反應(yīng)等，操作都不復(fù)雜。        此外，F(xiàn)QPCR中的標準品也是該技術(shù)能否準確定量模板的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。本實驗獲得的pGEMTEasyCAP10重組質(zhì)粒穩(wěn)定、純化方法簡單、易于定量測定、易于大量擴增、純化和保存，是FQPCR中最常使

20、用的定量標準品。因此完全可以滿足臨床對CN CAP10 mRNA的定量測定。    【參考文獻】  1 Chang Y C,KwonChung K J. Complementation of a capsuledeficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulenceJ. Mol Cell Biol, 1994,14(7):49124919.2 Chang Y C,Chung K. Isolation, characterization, and localization of a capsuleassociated gene, CAP10, of Cryptococcus neoformansJ. Journal of Bacterbiology, 1999,181(18):56365643.3 Harrison T S. Cryptococcus neoformans and Cryptococcosis J.