細菌基因組DNA的提取ppt課件

1、實驗：細菌基因組實驗：細菌基因組DNADNA的提取的提取 116229 于 妍116230116220 杜 輝116222 主講人：1;.目錄目錄一、實驗目的二、實驗原理三、儀器、試劑四、實驗方法和步驟五、實驗本卷須知六、DNA提取常見問題七、問題與討論2;.一、實驗目的一、實驗目的學會細菌基因組DNA的提取方法察看提取出來的DNA物質(zhì)3;.二、實驗原理二、實驗原理 DNA DNA在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)構(gòu)成復合物的方式存在，因此提取出脫氧核糖核蛋白復在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)構(gòu)成復合物的方式存在，因此提取出脫氧核糖核蛋白復合物后，必需將其中蛋白質(zhì)去除。在堿性條件下，用外表活性劑合物后，必需將其中蛋白質(zhì)

2、去除。在堿性條件下，用外表活性劑SDSSDS將細菌細胞將細菌細胞壁破裂，然后用高濃度的壁破裂，然后用高濃度的NaClNaCl沉淀蛋白質(zhì)雜質(zhì)，經(jīng)過氯仿抽提進一步去掉蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)雜質(zhì)，經(jīng)過氯仿抽提進一步去掉蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，經(jīng)乙醇沉淀，得到較純的等雜質(zhì)，經(jīng)乙醇沉淀，得到較純的DNADNA。4;.三、儀器、試劑三、儀器、試劑1、儀器 離心管、離心機、試管、吸量管2、試劑1活資料：大腸桿菌E.coli或枯草桿菌Bacillus subtilis2培育基：LB液體培育基3溶菌酶：100g/ml4裂解液：40mmol/Ltris-HCl,pH8.0,20mmol/L乙酸鈉，1mol/LEDTA，1%SDS

3、5;.51%SDS十二烷基硫酸鈉：1gSDS溶于100ml 蒸餾水，滅菌后-4保管6mol/LNaCl：稱取292.5gNaCl，溶于1000ml蒸餾水，滅 菌后-4保管。7無水乙醇及70%乙醇8超純水9TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCl， 1mmol/LEDTA-Na2pH：8.010飽和酚11氯仿：異戊醇25：16;.四、實驗方法和步驟四、實驗方法和步驟1、DNA提取的普通方法破碎細胞破碎細胞提取提取純化純化I. I.資料預備資料預備II.II.破碎細胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細胞或包膜內(nèi)容物釋放III.III.核酸分別、純化核酸分別、純化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)沉淀

4、或吸附核酸，并去除雜質(zhì) V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中7;.四、實驗方法和步驟四、實驗方法和步驟2、DNA提取的實驗步驟菌體培育菌體培育37 37 、1618h1618h菌體搜集菌體搜集12000r/min、30sNaCl充分混勻充分混勻12000r/min12000r/min，10min10min棄上清液棄上清液200L裂解緩沖液裂解緩沖液轉(zhuǎn)移上清置新離心轉(zhuǎn)移上清置新離心管管加加Tris飽和苯酚飽和苯酚混勻混勻12000rmin12000rmin，3min3min取水層加氯仿取水層加氯仿混勻混勻12000r/min12000r/min、3min3min取上層清液

5、加無水乙取上層清液加無水乙醇醇12000r/min12000r/min、3min3min棄上清棄上清沉淀加沉淀加400L400L70%70%乙醇乙醇洗兩次洗兩次真空枯燥真空枯燥溶解溶解DNADNA-20 -20 冰箱冰箱8;.五、實驗本卷須知五、實驗本卷須知1 1、資料應適量，過多會影響裂解，導致、資料應適量，過多會影響裂解，導致DNADNA量少，純度低。量少，純度低。2 2、采用有機酚、采用有機酚/ /氯仿抽提時應充分混勻，但動作要輕柔。氯仿抽提時應充分混勻，但動作要輕柔。3 3、離心分別兩相時，應保證一定的轉(zhuǎn)速和時間。、離心分別兩相時，應保證一定的轉(zhuǎn)速和時間。4 4、沉淀后運用、沉淀后運用

6、7070的乙醇洗滌，以除去鹽離子等。的乙醇洗滌，以除去鹽離子等。5 5、晾干、晾干DNADNA，讓乙醇充分揮發(fā)不要過分枯燥。，讓乙醇充分揮發(fā)不要過分枯燥。9;.1 1、DNADNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)2 2、DNADNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反響制后續(xù)酶解反響3 3、DNADNA中殘留有金屬離子中殘留有金屬離子1 1、重新純化、重新純化DNADNA，去除蛋白、多糖、多，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)酚等雜質(zhì)2 2、重新沉淀、重新沉淀DNADNA，讓酒精充分揮發(fā)，讓酒精充分揮發(fā)3 3、添加、添加7070乙醇洗滌的次數(shù)乙醇

7、洗滌的次數(shù)2-32-3次次六、六、DNA提取常見問題提取常見問題問題一：問題一：DNADNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCRPCR反響反響原原 因因?qū)Σ卟?0;.111 1、資料不新穎或反復凍融、資料不新穎或反復凍融2 2、未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性、未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性3 3、提取過程操作過于猛烈，、提取過程操作過于猛烈，DNADNA被機械打斷被機械打斷4 4、外源核酸酶污染、外源核酸酶污染5 5、反復凍融、反復凍融問題二：問題二：DNADNA降解降解對對策策 緣由緣由1 1、盡量取新穎資料，低溫保管資料防止反復、盡量取新穎資料，低溫保管資料防止反復凍融凍融2

8、2、液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前參與、液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前參與裂解緩沖液裂解緩沖液3 3、在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的資料的、在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的資料的DNADNA時，可添加裂解液中螯合劑的含量時，可添加裂解液中螯合劑的含量4 4、細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔、細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔5 5、一切試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌、一切試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌6 6、將、將DNADNA分裝保管于緩沖液中，防止反復凍分裝保管于緩沖液中，防止反復凍融融;.1 1、簡要表達酚氯仿抽提體系后出現(xiàn)的景象及其成因。、簡要表達酚氯仿抽提體系后出現(xiàn)的景象及其成因。 酚氯仿抽提酚氯仿抽提DNADNA后，會使溶液分層，上層為水相，含有后，會使溶液分層，上層為水相，含有DNADNA；中間為蛋白有時看不到；下層為有機相。緣由是酚；中間為蛋白有時看不到；下層為有機相。緣由是酚氯仿可以使蛋白量變性，從而從溶液中析出，但是蛋白密度氯仿可以使蛋白量變性，從而從溶液中析出，但是蛋白密度會小于酚氯仿，所以離心后它分布在中間；而會小于酚氯仿，所以離心后它分布在中間；而DNADNA溶于水而不溶于水而不溶于有機相。溶于有機相。2 2、沉淀時為什么要用無水乙醇？、沉淀時為什么要用無水乙醇？ 是由于是由于DNADNA不溶于乙醇，