細菌基因組DNA的提取ppt課件

1、實驗：細菌基因組實驗：細菌基因組DNADNA的提取的提取 116229 于 妍116230116220 杜 輝116222 主講人：1;.目錄目錄一、實驗目的二、實驗原理三、儀器、試劑四、實驗方法和步驟五、實驗本卷須知六、DNA提取常見問題七、問題與討論2;.一、實驗目的一、實驗目的學會細菌基因組DNA的提取方法察看提取出來的DNA物質3;.二、實驗原理二、實驗原理 DNA DNA在生物體內是與蛋白質構成復合物的方式存在，因此提取出脫氧核糖核蛋白復在生物體內是與蛋白質構成復合物的方式存在，因此提取出脫氧核糖核蛋白復合物后，必需將其中蛋白質去除。在堿性條件下，用外表活性劑合物后，必需將其中蛋白質

2、去除。在堿性條件下，用外表活性劑SDSSDS將細菌細胞將細菌細胞壁破裂，然后用高濃度的壁破裂，然后用高濃度的NaClNaCl沉淀蛋白質雜質，經(jīng)過氯仿抽提進一步去掉蛋白質沉淀蛋白質雜質，經(jīng)過氯仿抽提進一步去掉蛋白質等雜質，經(jīng)乙醇沉淀，得到較純的等雜質，經(jīng)乙醇沉淀，得到較純的DNADNA。4;.三、儀器、試劑三、儀器、試劑1、儀器 離心管、離心機、試管、吸量管2、試劑1活資料：大腸桿菌E.coli或枯草桿菌Bacillus subtilis2培育基：LB液體培育基3溶菌酶：100g/ml4裂解液：40mmol/Ltris-HCl,pH8.0,20mmol/L乙酸鈉，1mol/LEDTA，1%SDS

3、5;.51%SDS十二烷基硫酸鈉：1gSDS溶于100ml 蒸餾水，滅菌后-4保管6mol/LNaCl：稱取292.5gNaCl，溶于1000ml蒸餾水，滅 菌后-4保管。7無水乙醇及70%乙醇8超純水9TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCl， 1mmol/LEDTA-Na2pH：8.010飽和酚11氯仿：異戊醇25：16;.四、實驗方法和步驟四、實驗方法和步驟1、DNA提取的普通方法破碎細胞破碎細胞提取提取純化純化I. I.資料預備資料預備II.II.破碎細胞或包膜內容物釋放破碎細胞或包膜內容物釋放III.III.核酸分別、純化核酸分別、純化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質沉淀

4、或吸附核酸，并去除雜質 V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中7;.四、實驗方法和步驟四、實驗方法和步驟2、DNA提取的實驗步驟菌體培育菌體培育37 37 、1618h1618h菌體搜集菌體搜集12000r/min、30sNaCl充分混勻充分混勻12000r/min12000r/min，10min10min棄上清液棄上清液200L裂解緩沖液裂解緩沖液轉移上清置新離心轉移上清置新離心管管加加Tris飽和苯酚飽和苯酚混勻混勻12000rmin12000rmin，3min3min取水層加氯仿取水層加氯仿混勻混勻12000r/min12000r/min、3min3min取上層清液

5、加無水乙取上層清液加無水乙醇醇12000r/min12000r/min、3min3min棄上清棄上清沉淀加沉淀加400L400L70%70%乙醇乙醇洗兩次洗兩次真空枯燥真空枯燥溶解溶解DNADNA-20 -20 冰箱冰箱8;.五、實驗本卷須知五、實驗本卷須知1 1、資料應適量，過多會影響裂解，導致、資料應適量，過多會影響裂解，導致DNADNA量少，純度低。量少，純度低。2 2、采用有機酚、采用有機酚/ /氯仿抽提時應充分混勻，但動作要輕柔。氯仿抽提時應充分混勻，但動作要輕柔。3 3、離心分別兩相時，應保證一定的轉速和時間。、離心分別兩相時，應保證一定的轉速和時間。4 4、沉淀后運用、沉淀后運用

6、7070的乙醇洗滌，以除去鹽離子等。的乙醇洗滌，以除去鹽離子等。5 5、晾干、晾干DNADNA，讓乙醇充分揮發(fā)不要過分枯燥。，讓乙醇充分揮發(fā)不要過分枯燥。9;.1 1、DNADNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質中含有蛋白、多糖、多酚類雜質2 2、DNADNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反響制后續(xù)酶解反響3 3、DNADNA中殘留有金屬離子中殘留有金屬離子1 1、重新純化、重新純化DNADNA，去除蛋白、多糖、多，去除蛋白、多糖、多酚等雜質酚等雜質2 2、重新沉淀、重新沉淀DNADNA，讓酒精充分揮發(fā)，讓酒精充分揮發(fā)3 3、添加、添加7070乙醇洗滌的次數(shù)乙醇

7、洗滌的次數(shù)2-32-3次次六、六、DNA提取常見問題提取常見問題問題一：問題一：DNADNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCRPCR反響反響原原 因因對對策策10;.111 1、資料不新穎或反復凍融、資料不新穎或反復凍融2 2、未很好抑制內源核酸酶的活性、未很好抑制內源核酸酶的活性3 3、提取過程操作過于猛烈，、提取過程操作過于猛烈，DNADNA被機械打斷被機械打斷4 4、外源核酸酶污染、外源核酸酶污染5 5、反復凍融、反復凍融問題二：問題二：DNADNA降解降解對對策策 緣由緣由1 1、盡量取新穎資料，低溫保管資料防止反復、盡量取新穎資料，低溫保管資料防止反復凍融凍融2

8、2、液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前參與、液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前參與裂解緩沖液裂解緩沖液3 3、在提取內源核酸酶含量豐富的資料的、在提取內源核酸酶含量豐富的資料的DNADNA時，可添加裂解液中螯合劑的含量時，可添加裂解液中螯合劑的含量4 4、細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔、細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔5 5、一切試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌、一切試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌6 6、將、將DNADNA分裝保管于緩沖液中，防止反復凍分裝保管于緩沖液中，防止反復凍融融;.1 1、簡要表達酚氯仿抽提體系后出現(xiàn)的景象及其成因。、簡要表達酚氯仿抽提體系后出現(xiàn)的景象及其成因。 酚氯仿抽提酚氯仿抽提DNADNA后，會使溶液分層，上層為水相，含有后，會使溶液分層，上層為水相，含有DNADNA；中間為蛋白有時看不到；下層為有機相。緣由是酚；中間為蛋白有時看不到；下層為有機相。緣由是酚氯仿可以使蛋白量變性，從而從溶液中析出，但是蛋白密度氯仿可以使蛋白量變性，從而從溶液中析出，但是蛋白密度會小于酚氯仿，所以離心后它分布在中間；而會小于酚氯仿，所以離心后它分布在中間；而DNADNA溶于水而不溶于水而不溶于有機相。溶于有機相。2 2、沉淀時為什么要用無水乙醇？、沉淀時為什么要用無水乙醇？ 是由于是由于DNADNA不溶于乙醇，