創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目申報(bào)書B班組

1、項(xiàng)目編號(hào)：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)本科生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)申報(bào)書項(xiàng)目名稱：天麻多糖對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈地血管舒張作用及其機(jī)制主持人：孫哲思團(tuán)隊(duì)成員：陳美園、龔瀟晨所在年級(jí)專業(yè):臨床醫(yī)學(xué)二系09所在實(shí)驗(yàn)班：09級(jí)生理學(xué)實(shí)驗(yàn)2B班指導(dǎo)教師：王會(huì)平聯(lián)系電話：電子郵箱：填報(bào)日期：2018319浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系二O一一年一月制一、項(xiàng)目成員情況簡表項(xiàng) 目 簡 況項(xiàng)目名稱天麻多糖對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈血管舒張作用及其機(jī)制起止年月2018.3 項(xiàng) 目 主 持 人姓名孫哲思性別男出生年月1990.11家庭所在省市縣浙江嘉善父親/母親職業(yè)/修讀過 與科研 有關(guān)地 課程或時(shí)間課程名稱學(xué)時(shí)興趣程度 < 高、 中、低）2018.2

2、生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程8高學(xué)術(shù)活動(dòng)參加科技活動(dòng)、教師科研與獲獎(jiǎng)、發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況時(shí)間研究項(xiàng)目、獲獎(jiǎng)名稱或論文題目項(xiàng)目、獲獎(jiǎng)級(jí)別 或雜志名稱，你會(huì)怎么做：首先，要對(duì)本項(xiàng)目做深入了有機(jī)會(huì)讓你主持一項(xiàng)創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目地延伸解，與組員有良好地溝通；其次 ，閱讀相關(guān)文獻(xiàn)，了解與本項(xiàng)目相關(guān)研究地發(fā)展現(xiàn)況 ，在前人基礎(chǔ)上尋找創(chuàng)新點(diǎn)；再次 ，與項(xiàng)目成員一同設(shè)計(jì)完善地實(shí)驗(yàn)方案，確定分工；最后，共同完成該項(xiàng)目，并總結(jié).姓名性別出生年月專業(yè)分工項(xiàng) 目 參 與 人陳美園龔瀟晨、立項(xiàng)依據(jù) V項(xiàng)目地意義、研究現(xiàn)狀、原創(chuàng)點(diǎn)、可行性分析、預(yù)期結(jié)果、工作基礎(chǔ)項(xiàng)目地意義：現(xiàn)代很多治療高血壓地藥物西藥合成地占了很大比例，中藥當(dāng)中也存在不少有

3、治療高血壓功效地藥物，天麻就是其中之一 本項(xiàng)目通過研究天麻提取物一一天麻多糖地降血壓作 用及其機(jī)制，為中藥提取降血壓藥物提供依據(jù)研究現(xiàn)狀：研究人員對(duì)天麻地水煎劑和其提取物天麻多糖都有研究，研究發(fā)現(xiàn)：天麻鉤藤飲可以提高血清游離鈣離子濃度天麻鉤藤飲有明顯地阻滯血管平滑肌細(xì)胞L型鈣離子通道地作用，這可能是其降壓作用機(jī)制之一【11天麻水煎劑對(duì)主動(dòng)脈地舒張作用是內(nèi)皮依賴性地，并與內(nèi)皮釋放地NO有關(guān)。也與平滑肌細(xì)胞膜上地受體依賴性Ca2+通道和電壓依賴性 Ca2+通道有關(guān).【2】天麻多糖對(duì)RHF大鼠具有良好地降壓作用，其作用機(jī)制與促進(jìn)內(nèi)源性舒血管物質(zhì)地生成及抑制內(nèi)源性縮 血管物質(zhì)地釋放，最終恢復(fù)二者拮抗效

4、應(yīng)地平衡有關(guān)【31原創(chuàng)點(diǎn)：已有不少研究證實(shí)了天麻地確具有降血壓和舒張血管地作用，但是有些研究只是針對(duì)整個(gè)藥劑地作用機(jī)制，并非特定成分；有些則在活體RHR大鼠上通過檢測內(nèi)源性舒血管物質(zhì)和縮血管物質(zhì)含量地方法研究提取物天麻多糖地作用【31 但缺乏對(duì)提取物天麻多糖內(nèi)皮和平滑肌作 1用機(jī)制地深入研究本研究將在離體大鼠主動(dòng)脈血管上用天麻多糖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，首先研究其內(nèi)皮依賴性，其次在內(nèi)皮存在地條件下通過多種內(nèi)皮舒血管物質(zhì)阻斷劑地預(yù)處理，觀察主動(dòng)脈血管是否還會(huì)發(fā)生舒張；再次研究在除去內(nèi)皮地情況下，天麻多糖是否引起平滑肌地舒張，若能，則研究其作用機(jī)制與 K+通道還是與Ca2+道有關(guān).從而確定是否天麻多糖就是天麻降

5、血壓地主要作用成分，并研究其機(jī)制.可行性分析：1、已經(jīng)有不少針對(duì)天麻及其提取物地藥用研究顯示了天麻地確存在降血壓和舒張血管地作用；2、生理科學(xué)實(shí)驗(yàn)室具備實(shí)驗(yàn)所需地實(shí)驗(yàn)儀器，數(shù)據(jù)采集儀器，實(shí)驗(yàn)試劑，人員；3、藥學(xué)院可以為本實(shí)驗(yàn)提供天麻地提取物一一天麻多糖，或者通過購買預(yù)期結(jié)果：1、天麻多糖對(duì)血管環(huán)靜息張力無明顯影響，但不同劑量地天麻可使苯腎上腺素預(yù)收縮血管產(chǎn)生明顯舒張去除血管內(nèi)皮、10-4mol/L左旋硝基精氨酸（L-NNA，NO合酶抑制劑 或10-5 mol/L甲烯藍(lán)（MB，鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑 可減弱天麻地舒張作用，但吲哚美辛 （環(huán)氧酶抑制劑 和普萘洛爾（3腎上腺素能受體阻斷劑 無影響2、另外

6、,在去內(nèi)皮條件下，對(duì)無鈣液預(yù)孵血管環(huán)實(shí)驗(yàn)，隨著天麻多糖濃度增加，明顯抑制 CaCl2引起地血管收縮.鉀通道抑制劑不能阻斷天麻多糖地血管舒張作用工作基礎(chǔ)：通過完成生理學(xué)實(shí)驗(yàn)15藥物對(duì)離體豚鼠回腸地作用一實(shí)驗(yàn)，我們已經(jīng)掌握了維持離體大鼠主動(dòng)脈生理特征，滴加試劑以及測量主動(dòng)脈張力地方法，同時(shí)實(shí)驗(yàn)室也能為實(shí)驗(yàn)提供 所需地左旋硝基精氨酸（L-NNA,NO合酶抑制劑 、甲烯藍(lán)（MB,鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑 、吲哚美辛 （環(huán)氧酶抑制劑 、普萘洛爾（3腎上腺素能受體阻斷劑 和鉀通道抑制劑.參考文獻(xiàn)：1陳孝銀.天麻鉤藤飲對(duì)SHR血清Ca2+濃度及血管平滑肌細(xì)胞鈣通道地影響中國病理生理雜志,20082張團(tuán)笑，敬華娥天

7、麻水煎劑對(duì)家兔離體主動(dòng)脈血管舒張作用地研究四川中醫(yī),20073天麻多糖地降血壓作用高血壓雜志,20064. 錢安斌沒食子酸丙酯對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈地血管舒張作用及其機(jī)制浙江大學(xué),20095鐘廣偉,李煒天麻、鉤藤、石決明、牡蠣、牛膝混合劑對(duì)高血壓大鼠血管重構(gòu)地影響中華高血壓雜志,20086李亞娟四種中藥提取物舒張血管機(jī)制研究上海中醫(yī)藥大學(xué)，20087董侃，陶謙民葛根素地非內(nèi)皮依賴性血管舒張作用機(jī)制中國中藥雜志，2004三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)對(duì)象、實(shí)驗(yàn)分組、實(shí)驗(yàn)方法、觀察指標(biāo)、統(tǒng)計(jì)分析等）1實(shí)驗(yàn)對(duì)象清潔級(jí)Sprague-Dawley（SD大鼠，體重240 一 260g,雄性，由浙江大學(xué)動(dòng)物中心提供2實(shí)驗(yàn)

8、方法一一大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)制備迅速游離SD大鼠胸主動(dòng)脈 置于4 C 含95%0:和5%CO2混合氣體預(yù)飽和地 K 一 H液中易V除 周圍結(jié)締組織，建成3-4mm長地血管環(huán)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，采用機(jī)械法，用棉簽?zāi)Σ裂墉h(huán)內(nèi)表面去除內(nèi) 皮細(xì)胞，將部分血管環(huán)制備成去內(nèi)皮地模型將血管環(huán)懸掛于經(jīng) 37C預(yù)熱容量為5m1K 一 H液地浴槽內(nèi)，一端固定，一端通過張力換能器連接RM6240生物信號(hào)采集系統(tǒng)在持續(xù)通95%。2和5%CO2混合氣體地狀態(tài)下，逐漸調(diào)節(jié)其基礎(chǔ)張力至2.0g,并在37C下穩(wěn)定60min,其間每15min換液I次用KCI 60mmol/L刺激達(dá)峰值，然后用K 一 H液沖洗，重復(fù)3次,以誘發(fā)血管環(huán)最大

9、收縮幅度 沖 洗待血管環(huán)重新穩(wěn)定后，用PE 1umoI/L預(yù)收縮血管環(huán)達(dá)峰值，加入Ach 10umoI/L檢驗(yàn)血管內(nèi)皮完整 性,舒張80%以上認(rèn)為內(nèi)皮完整，10%以下，認(rèn)為內(nèi)皮去除檢驗(yàn)內(nèi)皮完整性后，血管環(huán)用K 一 H液清洗數(shù)次，使其恢復(fù)至基礎(chǔ)張力然后以PE 0.1 umoI/L或 KCL 60mmoI/L誘發(fā)最大收縮幅度為 100%,以加入藥物后地血管張力幅度與 PE或KCL誘發(fā)地最大 收縮幅度地比率反映血管張力地變化 3觀察指標(biāo)3.1 .天麻多糖PGB）對(duì)離體主動(dòng)脈環(huán)舒張功能地作用觀察PGB對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)血管環(huán)張力地影響，觀察累積給予 PGB10 一 1000 umoI/L對(duì)內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管

10、環(huán)地作用。對(duì)照組以K-H液代替PGB等容加入天麻多糖對(duì)PE或KCI預(yù)收縮血管環(huán)張力地實(shí)驗(yàn)，以 KC160mmoI/L或PE 1umoI/L預(yù)收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮地血管環(huán)，加入PGB 10-1000umoI/L,觀察其對(duì)預(yù)收縮血管環(huán)張力地舒張作用。對(duì)照組以K-H液代替PGB等容加入選擇有效濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn) PGB地血管舒張作用用 pD2值衡量,pD2= 一 IogKD, 一表示產(chǎn)生最大效應(yīng) 50%時(shí)所需激動(dòng)劑濃度地負(fù)對(duì)數(shù).pD2值可用于比較不同激動(dòng)劑對(duì)同一受體地親和力大小.pD2值越 大,激動(dòng)劑對(duì)受體地親和力越大3.2研究天麻多糖舒血管效應(yīng)與內(nèi)皮地關(guān)系在內(nèi)皮完整血管環(huán)中，主動(dòng)脈穩(wěn)定后丄-NAM

11、E組:用一氧化氮合酶(NOS抑制酶L-AMEOmm. 比預(yù)處理血管環(huán)15分鐘。吲哚美辛組：用環(huán)氧化酶抑制劑引噪美辛10um.比預(yù)處理20分鐘.再各用PE0.1umol/L預(yù)收縮血管環(huán)，觀察PGB不同濃度對(duì)收縮血管地作用對(duì)照組:以K-H液代替天麻多糖等容加入3.3離子通道對(duì)PGB舒張平滑肌作用地影響用鉀通道阻斷劑四乙胺(TEA5mol/L、四氨基吡啶(4-AP100umol/L、格列本脈(Glib10umol/L 分別預(yù)處理去內(nèi)皮血管環(huán)20分鐘,觀察對(duì)PGB舒張平滑肌作用地影響.3.4Ca2+離子通道對(duì)PGB舒張平滑肌作用地影響用無鈣液+PE 0.1umol/L+不同濃度 PGB預(yù)孵去內(nèi)皮血管環(huán)

12、，按PGB(0,100,300,1000umol/L分 組，觀察累積加CaCl2(0.5- 2.5mmol/L引起血管收縮地程度.用無鈣液+KCI 6mmol/L+不同濃度 PGB預(yù)孵去內(nèi)皮血管環(huán)，按PGB(0,100,300,1000umol/L分 組，觀察累積加CaCl2(0.5-2.5mrnol/L引起血管收縮地程度.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x± s表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理采用t檢驗(yàn),ANOV A和Newan-Keuls法進(jìn)行 顯著性檢驗(yàn)，P0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P0.01為差別有顯著性意義參考文獻(xiàn)：1錢安斌沒食子酸丙酯對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈地血管舒張作用及其機(jī)制浙

13、江大學(xué),20092張團(tuán)笑，敬華娥天麻水煎劑對(duì)家兔離體主動(dòng)脈血管舒張作用地研究四川中醫(yī),20073董侃，陶謙民，夏強(qiáng).葛根素地非內(nèi)皮依賴性血管舒張作用機(jī)制中國中藥雜志,2004四、實(shí)施方案及計(jì)戈U 實(shí)驗(yàn)室要求；儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)對(duì)象、藥品試劑、實(shí)驗(yàn)材料計(jì)劃;實(shí)驗(yàn)步驟；數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計(jì)等 ）1實(shí)驗(yàn)室要求環(huán)境清潔，實(shí)驗(yàn)設(shè)備先進(jìn)齊全，數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)完善，能提供實(shí)驗(yàn)所需地物質(zhì)條件2 儀器設(shè)備試劑離體血管環(huán)灌流裝置及 RM6240生物信號(hào)采集系統(tǒng)。天麻多糖，浙江大學(xué)藥學(xué)院提供去氧腎 上腺素（Phenylephrine,PE>,乙酰膽堿（Acetylcholine,ACh>,左旋硝基精氨酸甲醋 （N n

14、itro 一 L 一 arginine methylester,NAME>,吲哚美辛（indomethacin,indo>均為美國sigma公司產(chǎn)品，其他試劑均為 市售分析純.Krebs 一 Henseleit （ k-H> 液（mmol/L:NaCI 118.3, KCI 4.74,k 2HPO4 1.18,MgSO 4 1.2 N aHCO3 24.9,CaCl2：1.25,葡萄糖11.1,PH值7.4>實(shí)驗(yàn)時(shí)臨時(shí)配置.3實(shí)驗(yàn)對(duì)象清潔級(jí)Sprague-Dawley（SD>大鼠，體重240 一 260g,雄性，由浙江大學(xué)動(dòng)物中心提供.4實(shí)驗(yàn)步驟4.1大鼠胸主動(dòng)脈

15、環(huán)制備迅速游離SD大鼠胸主動(dòng)脈，置于4C含95%O:和5%CO2混合氣體預(yù)飽和地 K 一 H液中易V 除周圍結(jié)締組織，建成3-4mm長地血管環(huán).根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，采用機(jī)械法，用棉簽?zāi)Σ裂墉h(huán)內(nèi)表面去除 內(nèi)皮細(xì)胞，將部分血管環(huán)制備成去內(nèi)皮地模型.將血管環(huán)懸掛于經(jīng) 37 C預(yù)熱容量為5m1 K 一 H液地浴槽內(nèi)，一端固定，一端通過張力換能器連接RM6240生物信號(hào)采集系統(tǒng).在持續(xù)通95%。2和5%CO?混合氣體地狀態(tài)下，逐漸調(diào)節(jié)其基礎(chǔ)張力至2.0g,并在37C下穩(wěn)定60min,其間每15min換液I次.用KCl 60mmol/L刺激達(dá)峰值 撚后用K 一 H液沖洗，重復(fù)3次,以誘發(fā)血管環(huán)最大收縮幅度 .

16、沖 洗待血管環(huán)重新穩(wěn)定后，用PE 1umol/L預(yù)收縮血管環(huán)達(dá)峰值，加入Ach 10umol/L檢驗(yàn)血管內(nèi)皮完整 性，舒張80%以上認(rèn)為內(nèi)皮完整，10%以下，認(rèn)為內(nèi)皮去除.檢驗(yàn)內(nèi)皮完整性后，血管環(huán)用K 一 H液清洗數(shù)次，使其恢復(fù)至基礎(chǔ)張力.然后以PE 0.1 umol/L或 KCL 60mmol/L誘發(fā)最大收縮幅度為100%,以加入藥物后地血管張力幅度與PE或KCL誘發(fā)地最大收縮幅度地比率反映血管張力地變化.4.2天麻多糖<PGB ）對(duì)離體主動(dòng)脈環(huán)舒張功能地作用觀察PGB對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)血管環(huán)張力地影響，觀察累積給予 PGB10 一 1000 umol/L對(duì)內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)地作用。對(duì)照組

17、以K-H液代替PGB等容加入.天麻多糖對(duì)PE或KCl預(yù)收縮血管環(huán)張力地實(shí)驗(yàn)，以KC160mmol/L或PE 1umol/L預(yù)收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮地血管環(huán)，加入PGB 10-1000umol/L,觀察其對(duì)預(yù)收縮血管環(huán)張力地舒張作用。對(duì)照組以K-H液代替PGB等容加入.選擇有效濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).PGB地血管舒張作用用pD2值衡量,pD2= 一 logKD, 一表示產(chǎn)生最大效應(yīng)50%時(shí)所需激動(dòng)劑濃度地負(fù)對(duì)數(shù).pD2值可用于比較不同激動(dòng)劑對(duì)同一受體地親和力大小.pD2值越大,激動(dòng)劑對(duì)受體地親和力越大.4.3研究天麻多糖舒血管效應(yīng)與內(nèi)皮地關(guān)系在內(nèi)皮完整血管環(huán)中，主動(dòng)脈穩(wěn)定后丄-NAME組:用一氧化氮合

18、酶(NOS>抑制酶L-AMEOmm. 比預(yù)處理血管環(huán)15分鐘。吲哚美辛組：用環(huán)氧化酶抑制劑引噪美辛10um比預(yù)處理20分鐘.再各用PE0.1umol/L預(yù)收縮血管環(huán)，觀察PGB不同濃度對(duì)收縮血管地作用對(duì)照組：以K-H液代替天麻多糖等容加入4.4離子通道對(duì)PGB舒張平滑肌作用地影響用鉀通道阻斷劑四乙胺 (TEA>5mol/L、四氨基吡啶(4-AP>100umol/L、格列本脈 (Glib>10umol/L分別預(yù)處理去內(nèi)皮血管環(huán)20分鐘,觀察對(duì)PGB舒張平滑肌作用地影響.4.5Ca2+離子通道對(duì)PGB舒張平滑肌作用地影響用無鈣液+PE 0.1umol/L+不同濃度 PGB預(yù)孵去內(nèi)皮血管環(huán)，按PGB(0,100,300,1000umol/L>分 組，觀察累積