海洋來源真菌Af11中吲哚二酮哌嗪類抗腫瘤活性成分的研究

1、海洋來源真菌Af11中吲哚二酮哌嗪類抗腫瘤活性成分的研究(1)        作者：趙文英 張亞鵬 朱天驕 方玉春 劉紅兵 顧謙群， 朱偉明 【摘要】 對(duì)海洋來源具有抗腫瘤活性的真菌Af11中活性次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，采用活性追蹤的方法從乙酸乙酯提取物中分離得到7個(gè)含吲哚基的二酮哌嗪類化合物，根據(jù)化合物的光譜特征和理化性質(zhì)分別鑒定為cycloLtryptophylLproline (1)，NPrenylcycloLtryptophylLproline (2)，tryprostatin B (3)，demethox

2、yfumitremorgin C (4)，fumitremorgin C (5)，cyclotryprostatins B (6)和fumitremorgin B (7)，其中化合物2為新天然產(chǎn)物。利用麗絲胺羅丹明法，對(duì)7個(gè)單體化合物的抗腫瘤活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。 【關(guān)鍵詞】 海洋來源真菌 吲哚二酮哌嗪 抗腫瘤活性    Studies on the indolyl diketopiperazine analogs produced    ABSTRACT To investigate the antitumor s

3、econdary metabolites of marinederived fungal Af11. Seven indolyl diketopiperazine compounds were isolated with bioassayguided separation procedure. The structures of these compounds were determined through extensive analysis of 1D and 2DNMR data. Their antitumor activities against K562 cell lines we

4、re preliminarily evaluated by the lissamine rhodamine B method. Compound 2 was a new natural product.    KEY WORDS Marinederived fungus; Indolyl diketopiperazine compounds; Antitumor activity    由于海洋環(huán)境的特殊性，賦予生活在海洋中的真菌在生理性狀和遺傳背景上與陸生真菌具有顯著差異，因此從海洋來源真菌代謝產(chǎn)物中尋找有效的抗

5、腫瘤先導(dǎo)化合物引起國內(nèi)、外學(xué)者的關(guān)注。經(jīng)過多年的不懈努力，人們已經(jīng)相繼從海洋來源的真菌中分出許多結(jié)構(gòu)新穎的具有抗腫瘤活性的化合物，其中以生物堿類成分居多。天然產(chǎn)物中的生物堿都是由氨基酸衍生而成的，其中二酮哌嗪類生物堿具有顯著生理活性，如由苯丙氨酸和絲氨酸衍生的gliotoxin1是一種真菌毒素，具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性和免疫抑制作用；喹唑酮類生物堿fumiquinozolinesAI2是由色氨酸和鄰氨基苯甲酸衍生的，具有中等強(qiáng)度的細(xì)胞毒活性和抗真菌活性等。    近年來本實(shí)驗(yàn)室利用人慢性髓性白血病細(xì)胞(K562)的流式細(xì)胞術(shù)篩選模型開展了從海洋微生物中尋找新

6、的細(xì)胞周期抑制劑和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑等抗腫瘤先導(dǎo)化合物的研究工作。從海洋樣品中分離純化了近千株微生物菌株，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行活性篩選。其中從青島近海海泥樣品中分離出真菌Af11的發(fā)酵物顯示有明顯的壞死性細(xì)胞毒活性和細(xì)胞周期抑制作用，采用活性追蹤的分離方法從其活性部位中分離得到個(gè)含吲哚基的二酮哌嗪類化合物。本文主要報(bào)道該類化合物的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定和抗腫瘤活性。    1 材料與方法    1.1 儀器與試劑    質(zhì)譜用AutospecUltimaTOF型質(zhì)譜儀，核磁共振譜用日本J

7、EOL JNMECP600型核磁共振儀測定。分析用高效液相色譜儀：Waters公司產(chǎn)品Waters 600，Waters 996二極管陣列檢測器，Millennium32工作站，Capcell Pak C18柱：(4.6mm×250mm，5m)。制備用高效液相色譜儀：日本島津公司產(chǎn)品LC6AD，SPDM20 AVP檢測器，SCL10AV型系統(tǒng)控制器，Capcell Park C18柱：(20mm×250mm，5m)。柱層析及薄層層析用硅膠H(1040m)：青島海洋化工集團(tuán)公司。SephadexTM LH20：Pharmacia公司?；钚詼y試采用K562細(xì)胞。胎牛血清(FBS

8、)和RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基分別為Hyclone公司(Cat.No.STF721)和Gibcobrl公司產(chǎn)品。麗絲胺羅丹明B(lissamine rhodamine B，SRB)為Sigma公司產(chǎn)品。    1.2 菌種發(fā)酵    按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法取真菌適量，接種到PDA瓊脂固體斜面培養(yǎng)基上，在28培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。用接種針挑取適量孢子和菌體，接種到含100ml種子培養(yǎng)液的500ml三角燒瓶中，置搖床中，在28、120r/min條件下培養(yǎng)48h，獲得種子培養(yǎng)液。    

9、;取該種子培養(yǎng)液適量，按5%的接種量接種到內(nèi)裝150ml培養(yǎng)液的500ml三角燒瓶中，置28、120r/min的搖床上發(fā)酵7d，獲得菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液。    1.3 菌株提取物的制備    將菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液離心，分為上清液和菌絲體。取上清液，用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，得上清液的乙酸乙酯萃取液。菌絲體用80%丙酮水溶液超聲破碎提取3次，合并提取液，減壓濃縮至不含丙酮后，用乙酸乙酯萃取三次，萃取液與上清液的乙酸乙酯萃取液合并，減壓濃縮至干，得到該菌株的乙酸乙酯萃取物(粗提物35g)。  &#

10、160; 1.4 活性成分的追蹤分離    取菌株發(fā)酵培養(yǎng)物的粗提物，以石油醚丙酮為洗脫溶劑系統(tǒng)進(jìn)行減壓柱層析，共得到10個(gè)組分。采用K562細(xì)胞為篩選模型，檢測每個(gè)組份的活性?；钚越M分Fr.6經(jīng)Sephadex LH20，氯仿甲醇(11)洗脫，得Fr.64，重結(jié)晶得化合物7(39mg)?；钚越M分Fr.8經(jīng)常壓柱層析，用CHCl3洗脫，得到5個(gè)組分，其中Fr.83重結(jié)晶得化合物1(80mg)。活性組分Fr.9減壓柱層析，以氯仿甲醇混合溶劑為洗脫系統(tǒng)，得到9個(gè)組分。其中Fr.96經(jīng)半制備反相高效液相色譜，乙腈水(3070，V/V)洗脫，分別得到化

11、合物2(5mg)、3(11mg)、4(25mg)、5(34mg)和6(4.6mg)。    1.5 活性測試    按照文獻(xiàn)3采用SRB法，結(jié)合顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。    2 結(jié)果與討論    2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定    化合物1淡黃色結(jié)晶(氯仿)，ESIMS給出284M H 偽分子離子峰，結(jié)合1H和13CNMR譜，推出分子式為C16H17N3O2。IR譜中給出1674和1652cm-1典型

12、的酰胺羰基吸收，與13CNMR中的169.3和165.5處的信號(hào)相對(duì)應(yīng)，提示該化合物為二氧哌嗪類。1HNMR中顯示有鄰二取代的苯環(huán)(7.58d，J=8.0Hz，4H；7.37d，J=8.0Hz，7H；7.22td，J=8.0，1.1Hz，6H；7.14d，J=8.04，1.1Hz，5H)；13CNMR和DEPT譜中給出2個(gè)酰胺羰基信號(hào)和苯環(huán)上的碳信號(hào)，還顯示有1個(gè)sp2雜化的季碳信號(hào)(109.5)，3個(gè)次甲基(其中1個(gè)sp2雜化)和4個(gè)亞甲基信號(hào)，推測結(jié)構(gòu)中可能含有吲哚環(huán)。從1H1H COSY和HMQC譜推出分子中有脯氨酸殘基， 結(jié)合HMBC譜并根據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)4，得出化合物1為cycloLtry

13、ptophylLproline(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不要用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。    化合物2黃色油狀，ESIMS給出352M H 、374M Na 和390M K 偽分子離子峰，結(jié)合1H和13CNMR譜，推出分子式為C21H25N3O2。比較化合物1和2的1H和13CNMR譜，兩者極其相似，2比1多出2個(gè)甲基、1個(gè)亞甲基、1個(gè)烯烴質(zhì)子信號(hào)和1個(gè)sp2雜化季碳信號(hào)而缺少了

14、1個(gè)N上活潑氫信號(hào)，推測其N上氫被1個(gè)異戊烯基所取代。與文獻(xiàn)5相對(duì)照，確定該化合物為NPrenylcycloLtryptophylLproline，2000年SanzCervera等曾合成出此化合物，本文首次從天然產(chǎn)物中分離(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。    化合物3白色結(jié)晶(氯仿)，ESIMS給出352M H 偽分子離子峰，與化合物2為同分異構(gòu)體，分子式為C21H25N3O2。比較2和3的1H和13CNMR譜，發(fā)現(xiàn)3比2少了1個(gè)sp2雜化的次甲基，而多了1個(gè)N上的活潑氫，并且在2中與N相連的烯丙基質(zhì)子也由4.67向高場移至3.46。推測

15、在化合物2中連在N上的異戊烯基轉(zhuǎn)移到與N相鄰的2位上。與文獻(xiàn)對(duì)照6確定該化合物為tryprostatin B(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。        化合物4白色結(jié)晶(氯仿)，ESIMS給出350M H 和372M Na 偽分子離子峰，結(jié)合1H和13CNMR譜，推出分子式為C21H23N3O2。比較化合物4和3的1H和13CNMR譜，4比3少了1個(gè)N上的活潑氫和1個(gè)亞甲基(3.46)，而在6.04處多了1個(gè)次甲基信號(hào)。推測異戊烯基上的亞甲基與鄰近哌嗪環(huán)上的N相連形成1個(gè)新的環(huán)。對(duì)照文獻(xiàn)6，確定該化

16、合物為demethoxyfumitremorgin C(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。    化合物5為淡黃色結(jié)晶(氯仿)，ESIMS給出380M H 和402M Na 偽分子離子峰，結(jié)合1H和13CNMR譜，推出分子式為C22H25N3O3?；衔?的1HNMR信號(hào)比4多了1個(gè)甲氧基信號(hào)(3.81)，而在低場顯著的1，2二取代苯環(huán)信號(hào)被1，2，4三取代的苯環(huán)信號(hào)所取代，因此推測化合物5是化合物4的甲氧基衍生物。這一推測也被13CNMR上出現(xiàn)的甲氧基信號(hào)(55.7)和連氧的sp2雜化的季碳(156.3)所證實(shí)。對(duì)照文獻(xiàn)6確定化合物5為fumi

17、tremorgin C(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。    化合物6白色結(jié)晶(氯仿)，ESIMS給出448M Na 和462M K 偽分子離子峰，結(jié)合1H和13CNMR譜，推出分子式為C23H27N3O5。從13CNMR譜上比較，化合物6比5多了1個(gè)甲氧基(56.595)和1個(gè)連氧季碳(84.7)，少了1個(gè)亞甲基，并且次甲基向低場移了20.2(76.8)，推測其與氧相連。其他碳譜數(shù)據(jù)基本相同。結(jié)合1HNMR譜數(shù)據(jù)并對(duì)照文獻(xiàn)7，推出該化合物為cyclotryprostatins B(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。 

18、60;  化合物7淡黃色結(jié)晶(氯仿)，ESIMS給出9812M Na 和9972M K 偽分子離子峰，結(jié)合1H和13CNMR譜，推出分子式為C27H33N3O5。從1H和13CNMR譜上比較，化合物7比6多了2個(gè)甲基(C 18.0，H 1.84；C 25.3，H 1.68)、1個(gè)亞甲基(C 41.5，H 4.52)和1個(gè)次甲基(C 120.2，H 5.01)，1個(gè)季碳(C 134.3)信號(hào)，其余信號(hào)基本(下轉(zhuǎn)第764頁)(上接第 頁)相同，推測化合物7比6多了1個(gè)異戊烯基，并且N1上的活潑氫信號(hào)消失，所以多出的這個(gè)異戊烯基應(yīng)連在N1上。這一推測可從HMBC譜上得到證實(shí)，23

19、H與9C和2C有相關(guān)性。對(duì)照文獻(xiàn)8確定化合物7為fumitremorgin B(Fig.1, Tab.1, Tab.2)。    2.2 抗腫瘤生物活性測試    采用SRB法測定了7個(gè)化合物的抗腫瘤活性，結(jié)果表明，化合物27具有弱的細(xì)胞毒活性，抑制率分別為19.7%(50g/ml)、17.4%(10g/ml)、11.5%(1g/ml)、25.6%(10g/ml)、13.1%(1g/ml)、14.3%(1g/ml)；這些化合物的抗腫瘤作用在1100g/ml范圍內(nèi)不具有濃度依賴性，化合物1未表現(xiàn)出抗腫瘤活性。

20、0;   化合物17是從海洋真菌中分到的一系列由簡單的環(huán)二肽衍生成的生物堿，其中化合物27又通過1經(jīng)異戊烯基化衍生而成。早在20世紀(jì)70年代，人們就發(fā)現(xiàn)這類化合物屬于真菌毒素，能使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生震顫，最近這類化合物更因其獨(dú)特的生理活性和特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)受到廣泛關(guān)注。Cui等6證實(shí)這類化合物對(duì)小鼠tsFT210細(xì)胞有周期抑制活性，將腫瘤細(xì)胞抑制在G2/M期。SanzCervera等5發(fā)現(xiàn)這類化合物對(duì)微管聚集有抑制作用，并且芳環(huán)上的甲氧基取代對(duì)其活性有影響，甲氧基可減弱細(xì)胞毒活性而增強(qiáng)干擾微管的活性。本文活性測試表明，這類化合物對(duì)K562細(xì)胞有弱的細(xì)胞毒活性，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，

21、色氨酸殘基上的C上的取代基為取向的化合物的活性比取向的活性明顯增強(qiáng)，為證實(shí)這推測，我們將采取化學(xué)合成的方法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，其構(gòu)效關(guān)系正在進(jìn)一步的研究中?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Vigushin D M, Mirsaidi N, Brooke G, et al. Gliotoxin is a dual inhibitor of farnesyltransferase and geranylgeranyltransferase I with antitumor activity against breast cancer in vivo J. Med Oncol,2004,21(1):212 Takah

22、ashi C, Matsushita T, Doi M, et al. Fumiquinazolines AG, novel metabolites of a fungus separated from a Pseudolabrus marine fish J. J Chem Soc Perkin Tran I,1995:23453 Skehan P, Storeng R, Scudiero D, et al. New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer drug screening J. J Natl Cancer Jnst,1990,82:11074 Birch A J, Russell R A. Studies in relation to biosynthesisXLIV: structural elucidations of brevianamides B, C, D, and F J. Tetrahedron,1972,28:29995 SanzCervera J F, Stocking E M, Usui T, et al. Synthesis and evaluat