流式微珠陣列法檢測IFN-γ誘導的Jurkat細胞Th1Th2細胞因子表達

1、流式微珠陣列法檢測IFN-誘導的Jurkat細胞Th1/Th2細胞因子表達    【摘要】  本研究旨在探討流式微珠陣列法檢測Th1/Th2細胞因子表達及IFN-應用于T淋巴細胞白血病治療的臨床價值。以不同濃度IFN-誘導培養(yǎng)Jurkat細胞48小時，用流式微珠陣列法檢測培養(yǎng)上清液中IL-2、IL-6、TNF-和IFN-表達，并采用流式細胞術檢測膜上IL-2受體（CD25）的表達。結(jié)果表明： IFN-誘導Jurkat細胞IL-2和TNF-的表達呈濃度依賴性升高，未檢測到IL-6表達，CD25表達明顯升高。結(jié)論： Jurkat細胞能被IFN-誘導

2、高表達Th1細胞因子和CD25，流式微珠陣列法能準確客觀地反映Th1/Th2細胞因子表達的動態(tài)變化。 【關鍵詞】  T淋巴細胞白血病Detection of Expression of Th1/Th2 Cytokines in Jurkat cell Treated with -Interferon  by Cytometric Bead ArrayAbstract  In order to explore the value of -interferon (IFN-)  in therapy of T lymphoid leukemia  a

3、nd role of  cytometric bead array (CBA) method in detection of Th1/Th2 cytokines expression，the  Jurkat cells were cultured  for 48 hours  in  different  concentration  of  IFN-，the expressions of IL-2，IL-6，INF- and TNF- in culture supernatants  were assa

4、yed by CBA method; CD25 expression was assayed by flow cytometry.The results showed that the  expressions of IL-2，TNF-   were enhanced in INF- dose-dependent  way，and the expression of CD25  was also enhanced，but there was no expression of IL-6. It is concluded that  Ju

5、rkat cells induced by   IFN- were able to express high-level  of Th1 cytokine and IL-2 membrane receptor (CD25)，and the CBA method can be used to exactly   evaluate the dynamic change of Th1/Th2 cytokines.Key words cytometric bead array; Th1/Th2 cytokine; IFN; T lymphoid leu

6、kemia    流式微珠陣列（cytometric bead array，CBA）是近年來發(fā)展起來的新技術，可在一份標本中同時檢測多達10種細胞因子（IFN-、TNF-、TNF-、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10），具有快速、簡便、準確的特點，而且靈敏度高（可達0.3 pg/ml），可以準確反映Th1/Th2平衡狀態(tài)1-4。有學者認為，IFN-可應用于T淋巴細胞白血病治療，但目前為止并無確鑿的實驗證據(jù)。Jurkat細胞株為T淋巴瘤研究常用模型，因此本研究組以流式微珠陣列法檢測IFN-誘導的Jurkat細胞Th1/Th2細胞因

7、子表達，同時檢測mIL-2R（IL-2膜上受體，CD25）表達，探討IFN-的抗腫瘤效應及作用機制。材料和方法材料RPMI 1640液體培養(yǎng)基（杭州科達生物公司產(chǎn)品），臨用前加入15%小牛血清（杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品）； Jurkat 細胞株（中國科學院上海細胞生物學研究所提供）； IFN-（上?？寺∩锔呒夹g有限公司生產(chǎn)）； 流式微珠陣列細胞因子檢測試劑盒（Bender Medsystems產(chǎn)品，Austria）；CD25 FITC單克隆抗體（美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品）。細胞培養(yǎng)以含15%滅活小牛血清的完全RPMI 1640培養(yǎng)液，于37、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)

8、Jurkat細胞，每2-3天換液，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。給藥處理IFN-以完全RPMI 1640培養(yǎng)液配成1×106 U/ml貯存液，4避光保存。以1×106/ml濃度接種對數(shù)生長期細胞于6孔板中，培養(yǎng)6小時后給藥。各孔藥物終濃度分別為0(對照組)、1 000、2 000、4 000、6 000、10 000 U/ml，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，收集細胞用于CD25檢測，細胞培養(yǎng)上清液用于細胞因子檢測。IFN-、TNF-、IL-6、IL-2的流式微珠陣列檢測按試劑盒操作說明準備好檢測緩沖液、微珠、生物素偶聯(lián)劑和親和素標記藻紅蛋白（phycoerythrin，PE)，以檢測緩沖

9、液預濕微孔板，加入不同濃度細胞因子標準品或25 l待測細胞培養(yǎng)上清液，同時每孔加入25 l微珠和50 l生物素偶聯(lián)劑，室溫振搖（500 rpm）孵育2小時，真空吸干液體，充分洗滌2次，每孔加入100 l檢測緩沖液和50 l親和素標記PE，繼續(xù)孵育1小時，真空吸干液體后洗滌2次，加入200  l檢測緩沖液并轉(zhuǎn)移到試管中，F(xiàn)ACScan (Becton Dickinson，USA) 流式細胞儀測定熒光強度，熒光通道為FL-2，采用Flowcytomix Pro分析軟件（聯(lián)科公司附贈）進行分析。藥物處理48小時后Jurkat細胞CD25表達的流式細胞術檢測收集1×106細胞，用P

10、BS洗滌1次后，加入CD25 FITC單克隆抗體，孵育15分鐘，充分洗滌后，F(xiàn)ACScan流式細胞儀測定熒光強度，激發(fā)波長為408 nm，采用Cellquest分析軟件進行分析。百事通 統(tǒng)計學處理每次實驗均獨立重復3次，以Excell軟件和Flowcytomix Pro分析軟件處理實驗數(shù)據(jù)。結(jié) 果IFN-、TNF-、IL-6、IL-2的流式微珠陣列檢測利用Flowcytomix Pro分析軟件建立各細胞因子熒光值與其實際濃度的標準曲線（圖1），各待測樣本細胞因子濃度根據(jù)其熒光值由標準曲線自動讀出，未以IFN-處理的Jurkat細胞中4種細胞因子均不表達，而加入IFN-后隨濃度的升高，上清液中I

11、L-2和TNF-濃度明顯升高，未檢測到IL-6表達（圖2）。CD25檢測IFN-在1 000-10 000 U/ml濃度下有誘導Jurkat細胞表達CD25分子的作用。IFN-濃度為6 000 U/ml時誘導作用最強，48小時培養(yǎng)后CD25表達率提高8%。IFN-濃度大于6 000 U/ml濃度之后，CD25分子表達率不再升高（圖3）。討 論流式微珠陣列法以微珠大小和熒光強度（道數(shù)）在同一反應體系中區(qū)分和定量檢測10種細胞因子：細胞因子抗體包被到兩種不同大小的微珠上：   5.5  m（包被IL-2、IL-6、IL-8、IL-10 和IFN-單克隆抗體）和4.4

12、m(包被IL-1、IL-4、IL-5和TNF-、TNF-單克隆抗體)，同一微珠上的抗體結(jié)合不同強度的熒光染料并被激發(fā)得到不同的熒光道數(shù)。如圖1所示，IL-2、IL-6、IFN-處于同一微珠不同的熒光檢測道數(shù)，TNF-則處于不同的微珠上，因此CBA方法能最大限度地消除不同反應體系所帶來的各種誤差和同一反應體系內(nèi)各細胞因子間的交叉反應。本方法能客觀動態(tài)的反映Th1/Th2細胞因子變化和平衡狀態(tài)，從而利于我們探討細胞因子間的相互影響和網(wǎng)絡效應。因流式微珠陣列法的多種優(yōu)點，美國食品和藥物管理局（FDA）和人類基因組計劃均要求使用該方法檢測細胞因子5。    本研究組以CB

13、A法測定IFN-誘導Jurkat細胞表達Th1/Th2細胞因子，研究結(jié)果顯示，IFN-處理過的Jurkat細胞IL-2、TNF-等 Th1型細胞因子表達量呈IFN-濃度依賴性升高，同時，CD25（mIL-2R） 表達也明顯升高，Th2型細胞因子IL-6則不表達。濃度優(yōu)勢的Th1型細胞因子預示著活躍的抗腫瘤免疫能力： IL-2刺激NK細胞或CTL細胞的殺瘤活性，TNF-抑制腫瘤細胞增殖并促使其凋亡；CD25表達升高將提高腫瘤細胞對IL-2的敏感性并增強抗腫瘤效應，一般認為這代表預后良好。本研究結(jié)果證實，IFN-具有應用于T淋巴細胞白血病治療的潛在價值，同時，本研究首次揭示了Jurkat細胞能被誘

14、導表達Th1類細胞因子及其受體，后者對T淋巴細胞白血病的治療有著重要意義，即體內(nèi)T淋巴瘤細胞可能具有同樣的誘導表達和形成局部優(yōu)勢的Th1細胞因子的能力，這一點還有待深入研究，但毫無疑問，對于準確和客觀地評價體內(nèi)Th1/Th2細胞因子動態(tài)變化，CBA法應當成為首選方法之一。【參考文獻】  1Hodge G，Hodge S，Haslam R，et al.Rapid simultaneous measurement of multiple cytokines using 100 sample volumes-association with neonatal sepsis.Clin Exp

15、 Immunol，2004； 137:402-4072Khan SS，Smith MS，Reda D，et al.Multiplex bead array assays for detection of soluble cytokines: comparisons of sensitivity and quantitative values among kits from multiple manufacturers.Cytometry B Clin Cytom，2004; 61:35-393Aoe K，Hiraki A，Murakami T，et al.Relative abundance and patterns of correlation among six cytokines in pleural fluid measured by cytometric bead array.Int J Mol Med，2003;12:193-1984Morgan E，Varro R，Sepulveda H，et al.Cytometric bead array: a multiplex