蛋白表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)步驟

1、蛋白表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)步驟(待改進(jìn))1、取適當(dāng)相應(yīng)蛋白高表達(dá)的動(dòng)物組織提t(yī)otal-RNA。2、設(shè)計(jì)蛋白表達(dá)引物。引物要去除信號(hào)肽,要加上適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)和保護(hù)堿基。3、RT-PCR,KODI擴(kuò)增獲取目的基因cDNA.4、雙酶切,將cDNA.克隆入PET28/32等表達(dá)載體。5、轉(zhuǎn)化到DH&感受態(tài)細(xì)菌中擴(kuò)增，提質(zhì)粒。6、將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株,挑菌檢測(cè)并保種。表達(dá)菌株如Bl21(DE3)、Rosettagami(DE3)、Bl21codon(DE3)等。7、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。1)將表達(dá)菌株在3mlLB培養(yǎng)基中搖至中搖至OD玄右，加入IPTG,濃度梯度從25dM到1mM。37度誘導(dǎo)過(guò)夜(一般3h以上即有大量

2、表達(dá))。2)SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。注：目的蛋白包涵體表達(dá)量一般會(huì)達(dá)到菌體蛋白的50%以上,在膠上可以看到明顯的粗大的條帶。3)將有表達(dá)的菌株10%T油彳種，保存1ml左右就足夠了，并記錄IPTG濃度范圍。甘油是用科m過(guò)濾除菌的，儲(chǔ)存濃度一般是30%-60%使用時(shí)自己計(jì)算用量。4)用上述IPTG濃度范圍的最低值誘導(dǎo)10ml表達(dá)菌，18度，低轉(zhuǎn)速(140-180rpm),誘導(dǎo)過(guò)夜作為包涵體檢測(cè)樣品。注意:1.如果表達(dá)的蛋白對(duì)菌體有毒性，可以在加IPTG之前的培養(yǎng)基中加入1%勺葡萄糖用來(lái)抑制本底表達(dá)。葡萄糖會(huì)隨著細(xì)菌的繁殖消耗殆盡,不會(huì)影響后面的表達(dá)。2.保種可以取一部分分成50l

3、一管，每次用一管，避免反復(fù)凍融。8、包涵體檢測(cè)。方案見(jiàn)附件29、如有上清表達(dá),則擴(kuò)大搖菌。1)取保種的表達(dá)菌株先搖10ml,37度,300rpm搖至。口=約5h左右，視菌種,也可過(guò)夜搖菌。2）將上一步中的8ml加入300ml培養(yǎng)基中37度,250rpm搖至OD=左右（約3h）,然后加IPTG（濃度同包涵體檢測(cè)中使用的濃度。）注：菌液濃度要適當(dāng)?shù)臐庖恍?否則第二天收集不到足夠的菌體,因?yàn)榈蜏氐娃D(zhuǎn)速細(xì)菌生長(zhǎng)非常緩慢。拿起錐形瓶對(duì)光搖動(dòng),看到有大量云霧狀菌體即可。另一方法是,將手指放在瓶底晃動(dòng),看不清手指為宜,不過(guò)此法宜受氣泡影響。3） 過(guò)夜搖菌,使用包涵體檢測(cè)的溫度（18左右）,轉(zhuǎn)速140rpm左

4、右。4）將菌液6000rpm,4min,4度離心收集菌體。加入20mMPBS洗一遍后用平衡緩沖液重懸。每250ml菌液用30ml到50ml平衡緩沖液,視菌液的濃度而定?？捎?支50ml的離心管同時(shí)離心,但是,離心管要重復(fù)使用,用完后洗凈保存。10、超聲波裂解。1）用6mm幅桿，35%功率，工作,7s休息,50min即可。注意:1.要冰浴。2.要隨時(shí)觀察裂解情況以防意外。3.要將探頭探入到溶液中下部,盡量不要打出大量氣泡。一般溶液量比較大的時(shí)候不會(huì)出現(xiàn)大量氣泡。4） 正常聲音為:孜孜聲,尖銳刺耳的聲音表明探頭位置不對(duì)或者功率太大或者探頭松動(dòng)等原因,要及時(shí)調(diào)整。溶液由渾濁變清透,由粘稠變不粘稠表明

5、裂解完成（后面3000轉(zhuǎn)離心時(shí),如果沉淀少說(shuō)明裂解的好）。5.超聲波破碎儀工作30分min要休息5min（即關(guān)閉總電源開(kāi)關(guān)）。注意:1.如果純化的蛋白較易被蛋白酶降解,在超聲裂解之前要加蛋白酶抑制劑（PMSF）,PMSF工作濃度為1%。2.如不能判斷是否裂解完全,就按上述條件裂解60分鐘,60分鐘足夠裂解。11、取得上清1）將破碎好的溶液收集到50ml離心管中。10000rpm,15min,4離心。沉淀為包涵體、細(xì)胞碎片和未破碎的細(xì)胞。輕輕的將上清倒出,盡量不要倒出沉淀。（此時(shí)可以測(cè)量一下pH值,pH值最好在左右。平衡buffer的pH是左右，裂解后上清就會(huì)在左右。）1）鎳柱處理。將1ml鎳柱

6、吸入空層析管中,待其中的液體流完后加入平衡緩沖液3ml。2）將10ml上清加到已經(jīng)平衡過(guò)的NI柱上,并將過(guò)柱的樣品重復(fù)上樣3次。（若是流速慢可以在柱子下面加一個(gè)針頭，或者用1ml的槍將膠體吹散。）取20“過(guò)柱后的樣品，以備跑膠。3）分別加20mM、40mM、60mM、80mM的咪唑梯度來(lái)洗脫雜蛋白。每個(gè)梯度分別的上樣量為4ml、2ml、2ml、2ml。每個(gè)次上樣的液體分前面1ml和后面1ml分別收集入EP管中,以備跑膠。注意:理論上是要將收集的溶液測(cè)量280nm處的吸光度,直到吸光度為零時(shí)再進(jìn)行下一個(gè)梯度的洗脫。實(shí)際上測(cè)不到零,怎么都會(huì)有一點(diǎn)的,上面說(shuō)的量已經(jīng)做夠洗脫了。4） 加Elution

7、Buffer將目的蛋白洗脫。上樣量為（將前面的單獨(dú)接入EP管，再將后面的4ml接入另外兩個(gè)EP管），留跑膠樣品。5）力口MES各NI柱重生。MESJ口10ml,流完后再加10mlMiliqH2O。流完后保存于2倍體積的20%乙醇中,鎳柱至少能重復(fù)利用6次。（尿素可能對(duì)NI柱有損傷。）注意:所有溶液使用前都要確定其pH是否正確，pH對(duì)掛柱及洗脫影響較大。饃柱所用溶液MES勺ph=,其余EquilibrationBufferpH=,上清pH=,WashBufferpH=,ElutionBufferpH=。13、跑膠驗(yàn)證。1）跑2塊的PAGE把所有的樣品都加上去，注意兩塊膠的濃分離比要相同兩塊膠才會(huì)

8、比較一致。2）跑膠順序:負(fù)對(duì)照、正對(duì)照、上清、過(guò)柱樣品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、E1、E2、MES3）300V快速壓膠5min左右,160V分離樣品50min左右。（也可以300V,30min,只是圖沒(méi)有160V好看。）4） 考馬斯亮藍(lán)染色。一般染色2h即可。5） 脫色。先用脫色劑1脫15min,再用脫色劑2脫過(guò)夜。14、純化上清-收集目的蛋白1) 將重生的鎳柱再次平衡(即加EquilibrationBuffer3ml)。2) 重復(fù)步驟12中的操作,只是wash時(shí)只用步驟12中摸好的咪唑濃度洗。15、跑膠驗(yàn)證。同步驟13這次膠圖要跑的漂亮一點(diǎn)(用160V),保存好

9、。16、透析。1)配制2L透析液(配方見(jiàn)附件1),并放于-20度冰箱預(yù)冷但不要結(jié)冰。2)透析袋(剪10cm即可)用透析袋處理液煮沸10min,用MILIQH2O充分洗凈。3) 用透析夾將透析袋夾住(將透析袋折疊一下會(huì)夾的更牢),將洗脫的蛋白樣品加入其中，置入提前預(yù)冷的500ml透析液(20mMPBS+50mMNaCl)中。冰浴下輕微磁力攪拌20min后置入4冰箱后換液。透析3次即可。注意:用廣口瓶裝透析液,將廣口瓶置于裝有冰的2L大燒杯中。冰浴以防活性降低。17、濃縮。1) 將透析好的樣品連同透析袋一起放在白色盒子中,用預(yù)冷的聚乙二醇2000固體包埋。2)30min后將吸水后呈漿糊狀的聚乙二醇

10、去除,加入新的固體聚乙二醇。3) 每隔10min觀察一次,一旦出現(xiàn)渾濁立即停止?jié)饪s。4) 透析袋用完后,洗凈,保存于20%乙醇中4存放。注意:濃縮過(guò)度后會(huì)有白色小顆?；蛐鯛罹w出現(xiàn),由于透析袋使溶液成薄層狀,透明度較高不易發(fā)現(xiàn)小顆粒或絮狀沉淀,要看仔細(xì)。如果看不到,可根據(jù)自己估計(jì)的蛋白量留1-2ml體積。用透析液將透析袋表面的聚乙二醇洗掉,吸取其中的溶液分裝后-20度保存。18、超濾法濃縮、透析蛋白。使用超濾法就可省去16、17兩步。1) 將4mlElution得到的蛋白溶液加入超濾管中。2) 配平。3)7400g,30min,4離心,結(jié)束時(shí)4ml變?yōu)?ml左右。濃縮4倍?？筛鶕?jù)需要選擇不同的

11、離心時(shí)間,以達(dá)到不同的濃縮倍數(shù)。可以幾次的Elution液一起濃縮。4）加入需要的蛋白儲(chǔ)存液至4ml,離心。重復(fù)操作可以使Elution液逐漸換為所需的蛋白儲(chǔ)存液。蛋白儲(chǔ)存液一般用20mMPBS+*mMNaC適當(dāng)濃度和pH的tris-HCl溶液。如果蛋白有沉淀達(dá)不到預(yù)定濃度可以添加適當(dāng)?shù)母视停?%-5%即可）助溶。5）收集。將溶液從超濾管中收集到EP管中，標(biāo)記好儲(chǔ)存液的成分，蛋白名稱，蛋白濃度（測(cè)量后）,制備日期。注:超濾管的使用方法見(jiàn)附件419、蛋白濃度測(cè)定。見(jiàn)附件320、蛋白活性測(cè)試。轉(zhuǎn)染細(xì)胞測(cè)量熒光。21、抗原處理。蛋白與弗氏佐劑混合成油包水狀。22、注射兔子。選擇合適的注射方式和合適的

12、免疫程序。23、收集免疫血清。提取抗體。24、抗體效價(jià)評(píng)定。附件1所需溶液配方:1）20mMPBS:20mMsodiumphosphate,300mMNaClpH試劑名稱NaH2PO4-2H2ONa2HPO4-12H2ONaCl用量（g）1L2）EquilibrationBuffer（平衡緩沖液）:PBSwith10mM咪唑pH3）WashBuffer（清洗緩沖液）:PBSwith25mM/50mM/75mM咪唑pH4）ElutionBuffer（洗脫緩沖液）:PBSwith250mM咪唑pH5)MES(再生緩沖液):20mM2-(N-morpholine)-ethanesulfonicaci

13、d,Msodiumchloride;pH。即MES+NaCl.6)透析袋處理液：2%(w/v)碳酸氫鈉和1mmol/LEDTA7)透析液：20mMPBS+50mMNaCl試劑名稱NaH2PO4-2H2ONa2HPO4-12H2ONaCl用量(g)1LTIPS:1-4的溶液可以一起配制。先配10ml8M的咪陛。再配1L的PBS,用500ml水將濃也。2mgm111.4ing/rnl0.8mg/mlRSA(hug)邳172p110即1144尸IH2OI44p11。即I72p136H1試劑溶解，取兩個(gè)50ml和一個(gè)150ml分別加到兩個(gè)100ml瓶子和一個(gè)500ml瓶子中，作為WashBuffer、

14、ElutionBuffer和EquilibrationBuffer,再向其分別加入適當(dāng)體積的8M咪口坐。最后,定容。WashBuffer、ElutionBuffer各配了100ml,EquilibrationBuffer配了300ml。PBS配了500ml。附件2包涵體檢測(cè)1 .搖10ml菌，加葡萄糖和相應(yīng)抗性。培養(yǎng)至OD600后離心加入新的培養(yǎng)基和相應(yīng)濃度的IPTG低溫（16-25度）誘導(dǎo)過(guò)夜（也可不離心，在原來(lái)LB中直接加IPTG）。在離心前取5006菌液作為負(fù)對(duì)照，誘導(dǎo)完成后取500微升作為正對(duì)照。正負(fù)對(duì)照不用超聲波裂解直接煮沸10min跑膠。2 .誘導(dǎo)完成后，用2mlEP管6000rp

15、m,2min,4度，收集10ml菌液。PBS（50mMPBS,300mMNaCl）重懸細(xì)菌。3 .裂解細(xì)胞。用超聲波破碎細(xì)胞直到懸液變清亮，一般15到30min。裂解3s,停止6s,裂解時(shí)冰上放置。4 .分離上清。5000rpm,4min,4除去未裂解的細(xì)菌和大的細(xì)菌碎片。然后,10000rpm,10min,4度。取上清于新的管中。取其中的20微升于200微的EP管中，力口5*SDSloadingbuffer混勻，煮沸10min。5 .重懸包涵體。用1000震蕩重懸包涵體，取20微于200微的EP管中加5微5*SDSloadingbuffer,煮沸10min。6 .正負(fù)對(duì)照的收集。離心收集正負(fù)

16、對(duì)照菌體，上清留下40til,加入10“5*SDSloadingbuffer,煮沸10min裂解。7 .跑聚丙烯酰胺凝膠。將正負(fù)對(duì)照及實(shí)驗(yàn)樣品一起跑膠。一般順序是:-,+,上清,包涵體.附件3蛋白濃度定量測(cè)試方案1 .將染色劑稀釋。稀釋5倍，取4ml染色劑于50ml離心管中,加16mlmiliqH2O.充分溶解后用科m的濾膜過(guò)濾于另50ml離心管中。（此劑量可測(cè)4個(gè)樣品。）2 .牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品的制備1）將凍干的BSA溶于去離子水中，溶解成濃度為1mg/ml,分裝為400-500“/支（可以室溫放置60天,-20度長(zhǎng)期保存）。2）將1mg/ml的BSA分別稀釋成、ml,各180科l

17、,另外加一管水為3 .染色。1） 取已過(guò)濾的染色劑分別加入13支（其中4支為待測(cè)樣品）管中。4個(gè)梯度各做一個(gè)重復(fù)，共8支，另外加1個(gè)樣品（或1+n個(gè)樣品）和1個(gè)blank,共10支EP管（或10+n支）,分別對(duì)應(yīng)標(biāo)記。2）將30“樣品和30“標(biāo)準(zhǔn)BSA及30“H2O分別加入上述EP管中。渦旋混勻。3）室溫孵育5min到60min05min后即開(kāi)始測(cè)量，在60min內(nèi)測(cè)完，越快越好，因?yàn)锳bsorbancewilincreaseovertime。4.吸光度的測(cè)量。600nm處測(cè)量，并記錄吸光度。注意：1.blank是染色液加30微升的水。2.從低濃度測(cè)量到高濃度。根據(jù)混合液的顏色大致判斷samp

18、le的濃度范圍,據(jù)此決定sample的測(cè)量順序。5. 比色皿的洗滌。用100%乙醇浸泡洗滌。6. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。利用excel工具取標(biāo)準(zhǔn)品的平均值制作線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線。附件4.4mlmillipore超濾離心管使用注意事項(xiàng)1.用前用miliq水潤(rùn)濕。度預(yù)冷。3 .離心力不能超過(guò)7500g。加速度設(shè)定為8.4 .離心時(shí)將離心管的兩膜片豎直到與地面垂直的角度后開(kāi)始離心,以使兩膜所受的壓力一5.使用完畢后，用miliq水洗凈，加入1mlNaOH泡24h,后加入1ml20%醇保存。如果要短期保存幾天,也可加水浸泡。附件5聚丙烯酰胺凝膠的制備及使用方法附件6.包涵體蛋白的提純與提上清中所用試劑不同之處:在EquilibrationBuffer、WashBuffer、ElutionBuffer中各加了6M尿素或鹽酸胍。尿素或鹽酸胍用來(lái)溶解包涵體蛋白。在裂解完后,離心時(shí)先3000rpm3min去除未裂解的細(xì)胞和大的碎片,再10000rpm15min離心,沉淀就是包涵體。用加了6M尿素或鹽酸瓜的EquilibrationBuffer溶解包涵體。后面的步驟跟提上清蛋白一致，只是所用EquilibrationBuffer、WashBuffer、ElutionBuffer