還原糖和總糖的測定3

1、還原糖和總糖的測定3,5-二硝基水楊酸比色法 作者：任大明 來源：生物秀 時間：2008-5-21 實驗儀器大全 實驗試劑大全一、目的掌握還原糖和總糖測定的基本原理，學習比色法測定還原糖的操作方法和分光光度計的使用。二、原理還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計）。還原糖在堿性條件

2、下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內，還原糖的量與棕紅色物質顏色的深淺成正比關系，利用分光光度計，在540nm 波長下測定光密度值，查對標準曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水，所以在計算多糖含量時應乘以0.9。三、實驗材料、主要儀器和試劑1 實驗材料小麥面粉；精密pH 試紙。2 主要儀器（1）具塞玻璃刻度試管：20mL×11（2）大離心管：50mL×2（3）燒杯：100mL×1（4）三角瓶：100mL×1（5）容量瓶：10

3、0mL×3（6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1（7）恒溫水浴鍋（8）沸水浴（9）離心機（10）扭力天平（11）分光光度計3 試劑（1）1mg/mL 葡萄糖標準液準確稱取80烘至恒重的分析純葡萄糖100mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉移到100mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，混勻，4冰箱中保存?zhèn)溆?。?）3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑將6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g 結晶酚和5g 亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL

4、，貯于棕色瓶中備用。（3）碘-碘化鉀溶液：稱取5g 碘和10g 碘化鉀，溶于100mL 蒸餾水中。（4）酚酞指示劑：稱取0.1g 酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。（5）6M HCl 和6M NaOH 各100mL。四、操作步驟1 制作葡萄糖標準曲線取7 支20mL 具塞刻度試管編號，按表1 分別加入濃度為1mg/mL 的葡萄糖標準液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，配成不同葡萄糖含量的反應液。表1 葡萄糖標準曲線制作將各管搖勻，在沸水浴中準確加熱5min，取出，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至20mL，加塞后顛倒混勻，在分光光度計上進行比色。調波長540nm，用0 號管調零點，測出1

5、6號管的光密度值。以光密度值為縱坐標，葡萄糖含量（mg）為橫坐標，在坐標紙上繪出標準曲線。實驗儀器大全 實驗試劑大全2 樣品中還原糖和總糖的測定（1）還原糖的提取準確稱取3.00g 食用面粉，放入100mL 燒杯中，先用少量蒸餾水調成糊狀，然后加入50mL 蒸餾水，攪勻，置于50恒溫水浴中保溫20min，使還原糖浸出。將浸出液（含沉淀）轉移到50mL 離心管中，于4 000r/min 下離心5min，沉淀可用20mL 蒸餾水洗一次，再離心，將二次離心的上清液收集在100mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測液。（2）總糖的水解和提取準確稱取1.00g 食用面粉，放入100mL

6、 三角瓶中，加15mL 蒸餾水及10mL 6M HCl，置沸水浴中加熱水解30min（水解是否完全可用碘-碘化鉀溶液檢查）。待三角瓶中的水解液冷卻后，加入1 滴酚酞指示劑，用6mol/LNaOH 中和至微紅色，用蒸餾水定容在100mL容量瓶中，混勻。將定容后的水解液過濾，取濾液10mL，移入另一100mL 容量瓶中定容，混勻，作為總糖待測液。（3）顯色和比色取4 支20mL 具塞刻度試管，編號，按表2 所示分別加入待測液和顯色劑，空白調零可使用制作標準曲線的0 號管。加熱、定容和比色等其余操作與制作標準曲線相同。五、結果與計算：計算出7、8 號管光密度值的平均值和9、10 管光密度值的平均值，

7、在標準曲線上分別查出相應的還原糖毫克數(shù)，按下式計算出樣品中還原糖和總糖的百分含量。六、附 注1 離心時對稱位置的離心管必須配平。2 標準曲線制作與樣品測定應同時進行顯色，并使用同一空白調零點和比色。3 面粉中還原糖含量較少，計算總糖時可將其合并入多糖一起考慮。七、思考題13,5-二硝基水楊酸比色法是如何對總糖進行測定的?2如何正確繪制和使用標準曲線?參考答案1植物中的總糖包括單糖、寡糖和多糖，單糖是還原糖，可直接測定。而沒有還原性的寡糖和多糖，需用高濃度的酸在加熱的條件下水解成有還原性的單糖，還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內，還原糖的量與棕紅色物質顏色的深淺成一定比例關系，利用分光光度計，在540nm 波長下測定光密度值，查對標準曲線并計算，可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需要加入一分子水，所以在計算多糖含量時應乘以0.9。2標準曲線應在坐標紙上繪制，橫坐標軸距坐標紙底邊1.52cm，標示出刻度和葡萄糖的毫克數(shù)；縱坐