羥乙基淀粉(13004)對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)

1、羥乙基淀粉(130/0.4)對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)周大春 馬曉旭 謝俊然 羅豐 金梅浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院邵逸夫醫(yī)院【摘要】 目的 觀察新一代羥乙基淀粉（130/0.4）對(duì)腎缺血再灌注損傷和免疫粘附分子ICAM-1表達(dá)的影響。方法 建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型，在缺血結(jié)束前開始輸液治療。隨機(jī)分為假手術(shù)組（C組）、生理鹽水組（S組）和羥乙基淀粉治療組。后者又按劑量分為W1組（5ml/kg）、W2組（10ml/kg）和W3組（20ml/kg）。再灌注24h后對(duì)比腎功能、腎小管損傷（Paller評(píng)分法）和腎組織ICAM-1表達(dá)。結(jié)果 缺血再灌注后腎功能受損，腎小管腫脹變性，ICAM-1表達(dá)明顯增強(qiáng)。

2、W2、W3組病變明顯減輕，ICAM-1表達(dá)少于S組（P<0.01）。但W1組與S組差別不顯著。結(jié)論 輸注1020ml/kg羥乙基淀粉（130/0.4）可以明顯減輕大鼠腎缺血再灌注損傷。抑制ICAM-1表達(dá)和活性是其可能的機(jī)制之一?！娟P(guān)鍵詞】 羥乙基淀粉；腎；再灌注損傷；胞間粘附分子1Protective effects of hydroxyethyl starch (130/0.4) against ischemia reperfusion injury of rat renal ZHOU Da-chun, MA Xiao-xu, XIE Jun-ran, LUO Feng, JIN M

3、ei. Department of Anesthesiology, Sir Run Run Shaw Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou, 310016 China【Abstract】 Objective To explore the Protective effects of hydroxyethyl starch (130/0.4) against ischemia reperfusion injury of rat renal and the role of intercellular adhesion

4、 molecule-1(ICAM-1). Method On a rat renal ischemia reperfusion model, animals were randomly assigned to receive sham surgery as control(Group C),normal saline(group S),HES 5ml/kg (group W1), HES 10mg/kg (group W2) or HES 20ml/kg(group W3). After reperfusion for 24h, renal function, renal tubular in

5、jury (Pallors scoring) and ICAM-1 expression were compared. Results Ischemia reperfusion impaired renal function, caused severe tubular damage and increase ICAM-1 expression. These changes were reduced in group W2 and W3 but not at W1. Conclusions Infusion 10-20ml/kg of hydroxyethyl starch (130/0.4)

6、 reduced ICAM-1 expression and was protective for rat renal against ischemia reperfusion injury.【Key words】 Hetastarch; Renal; Reperfusion injury; Intercellular adhesion molecule-1 羥乙基淀粉(130/0.4)對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)Protective effects of hydroxyethyl starch (130/0.4) against ischemia reperfusion injury of

7、 rat renal周大春 馬曉旭 謝俊然 羅豐 金梅缺血再灌注損傷是器官移植、休克、動(dòng)脈搭橋術(shù)后普遍存在的問題，腎臟作為高灌注器官，是發(fā)生缺血再灌注損傷的常見重要器官之一。免疫粘附分子及其介導(dǎo)的白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附作用是缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素1,2。羥乙基淀粉(HES)作為臨床常用的人工膠體，已被廣泛用于容量治療。本文觀察新一代羥乙基淀粉（130/0.4）對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷和腎臟免疫粘附分子（ICAM-1）表達(dá)的影響。1 材料和方法11 材料 健康成年SD大鼠，雌雄不拘，體重200260g，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，ICAM1免疫組化試劑盒( G25):SC28439購(gòu)于R&

8、amp;D systems，DAB顯色試劑盒購(gòu)于中杉金橋公司。1.2 方法1.2.1 動(dòng)物模型及分組 50只SD大鼠，隨機(jī)分為5組，每組10只,均以3水合氯醛(1ml/100g)腹腔注射麻醉后按無(wú)菌手術(shù)操作，左頸部切口，分離頸動(dòng)脈插入24G套管測(cè)平均動(dòng)脈壓。四肢皮下針電極穿刺連接八道生理記錄儀監(jiān)測(cè)心電圖和心率。直腸置探頭測(cè)體溫，采用加熱燈進(jìn)行保溫，維持體溫于3839。以上指標(biāo)采用澳大利亞拜普醫(yī)研設(shè)備公司生產(chǎn)的Powerlab/8SP八道生理記錄儀記錄各參數(shù)。經(jīng)腹正中切口暴露雙側(cè)腎臟，分離左腎動(dòng)脈，切除右腎。經(jīng)左側(cè)股靜脈置入24號(hào)套管針連接微量注射泵。各組處理分別如下：C組：假手術(shù)對(duì)照組，進(jìn)行手

9、術(shù)但不夾閉腎動(dòng)脈；S組：生理鹽水對(duì)照組，夾閉左腎動(dòng)脈60min，在開放腎動(dòng)脈前20min開始輸注生理鹽水20ml/kg；W組又分為3個(gè)亞組，為W1、W2和W3組，各組均夾閉左腎動(dòng)脈60min，在開放腎動(dòng)脈前20min分別輸注HES(130/0.4)（130/0.4）5ml/kg、10ml/kg和20ml/kg。生理鹽水和不同劑量的羥已基淀粉的輸注速度均為0.2ml/min3。 1.2.2 生化檢測(cè) 各組動(dòng)物于再灌注后24h取動(dòng)脈血2ml采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清肌酐(Cr)和尿素氮（BUN）。1.2.3 腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察 再灌注后24h取腎臟組織，10中性緩沖甲醛固定，石蠟包埋，切成4mm

10、厚的切片，HE染色，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，每個(gè)視野選擇10個(gè)小管評(píng)分，按50個(gè)腎小管計(jì)分(即5個(gè)視野)，其標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)4Paller法，腎小管明顯擴(kuò)張，細(xì)胞扁平1分，刷狀緣損傷或脫落1分或2分，管型2分腎小管腔內(nèi)有脫落的壞死細(xì)胞未形成管型或碎片1分。1.2.4 ICAM-1免疫組化染色及其定量分析 腎組織中ICAM1檢測(cè)方法為二步法: 石蠟片脫蠟置蒸餾水； PBS 沖洗3 min ×3 次； 置3 %過氧化氫甲醛溶液中20 min ； PBS 沖洗3 min ×3 次； 每張切片滴加第一抗體,置4 冰箱過夜； PBS 沖洗3 min ×3次； 滴加酶標(biāo)記的第二抗體孵

11、育40 min ； PBS沖洗3 min ×3 次； (9) 新鮮配制的DAB 溶液顯色310 min，用水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明,中性樹膠封固。在光學(xué)顯微鏡400倍下每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，用HHAS1圖像分析系統(tǒng)計(jì)算光密度值作為半定量參數(shù)，測(cè)量ICAM1的表達(dá)。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較用單因素方差分析，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、結(jié)果2.1 各組動(dòng)物在輸注生理鹽水或HES(130/0.4)前后平均動(dòng)脈壓（MAP）和心率（HR）沒有顯著差異。見表1。2.2 HES(130/0.4

12、)對(duì)腎功能的影響：再灌注24h后S組血清肌酐和尿素氮顯著高于C組；輸注HES(130/0.4)10ml/kg和20ml/kg可顯著改善再灌注后的腎功能損害（P<0.05或P<0.01），5ml/kg劑量組與S組比無(wú)明顯差異。見表2。2.3 腎組織學(xué)變化：再灌注24h后，光鏡下S組腎小管上皮細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)不同程度的變性與壞死，腎小管刷狀緣脫落或部分脫落，以近曲小管為甚，并見管型，腎間質(zhì)局部出血水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。W2和W3組的病理改變較S組明顯減輕光鏡下見腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性和壞死明顯減輕，腎小管Paller評(píng)分也少于S組（P<0.05或P<0.01），腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞

13、浸潤(rùn)也減少；W1組與S組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(圖1和表3)2.4 腎組織ICAM-1表達(dá)：C組腎臟ICAM-1僅在腎髓質(zhì)直小血管、腎小管周圍毛細(xì)血管少量表達(dá)。腎小管上皮不表達(dá)或低水平表達(dá)。再灌注后24h，S組腎臟ICAM-1表達(dá)明顯增強(qiáng)，且可見于腎小球毛細(xì)血管、系膜區(qū)及腎近曲小管上皮細(xì)胞。W2和W3組ICAM-1表達(dá)顯著少于S組（P<0.05或P<0.01），W1組與S組相比無(wú)明顯差異。（圖2和表3） Tab 1 change of MAP and HR during renal ischemic reperfusion injury，(IRI)（x±s, n=10）I

14、tem MAP(mmHg) HR After infusion Before infusion(次/min)After infusionGroup Before infusionGroup C87.4±9.288.2±7.9298±21287±19Group S89.6±11.288.3±10.7283±14285±12Group W187.6±7.987.8±11.2277±11275±13Group W286.9±8.787.2±10.0275

15、7;9280±20Group W389.6±11.089.3±8.7281±21284±19Tab 2 Change of renal fuction after renal IRI and tread with Hydroxyethyl Starch（x±s, n=10）BUN （mmol/L）Cr（mmol/L）Group C26.71±4.42 0.81±0.31Group S151.71±22.473.17±1.00Group W392.14±27.71*#1.57±

16、0.70 *#Group W298.85±22.87*#1.82±0.86 *#Group W1135.85±14.473.04±.29*P<0.05, * P<0.01 VS group S； #P<0.05, #P<0.01 VS group W1Tab 3 Change of Pallers score and mean density of ICAM-1 afterrenal IRI and tread with Hydroxyethyl Starch（x±s, n=10）PallerscoreICAM-1(de

17、nsity）Group C1.36±1.57105.02±23.55Group S43.20±15.75212.70±32.29Group W329.16±12.27*#161.24±25.32*#Group W233.56±16.62*182.00±21.94*Group W141.12±15.59214.08±33.87*P<0.05, * P<0.01 VS group S ；#P<0.05, #P<0.01 VS group W13 討 論腎臟缺血再灌注損傷是臨床

18、普遍存在的問題，在器官移植、失血性休克、動(dòng)脈搭橋手術(shù)等過程均可以發(fā)生。HES 200/0.5是臨床常用的血漿擴(kuò)容劑，有關(guān)多次使用后血漿組織蓄積問題、對(duì)凝血功能和腎功能的影響問題日益凸現(xiàn)， HES (130/0.4)是新一代羥乙基淀粉，其在分子量、取代級(jí)以及取代方式上改進(jìn)的優(yōu)化組合使其更安全、有效。在容量治療中發(fā)揮更大的作用5，7。本研究通過腎臟缺血再灌注損傷動(dòng)物模型研究了不同劑量的HES(130/0.4)對(duì)腎臟缺血再灌注損傷的影響以及可能的機(jī)制。結(jié)果表明一定劑量的HES(130/0.4)可以明顯改善腎臟缺血再灌注損傷,而且在一定范圍內(nèi),這種保護(hù)作用隨HES(130/0.4)劑量的增加而增加。對(duì)

19、于腎臟缺血再灌注損傷機(jī)制的研究涉及許多方面，其中免疫粘附分子（ICAM1）在腎臟缺血再灌注損傷中具有重要的作用 2,8 。ICAM1是表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及各種白細(xì)胞上的一種膜糖蛋白，是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間粘附的重要生物分子。其在機(jī)體的炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答中起著非常重要的作用9 。有研究發(fā)現(xiàn)腎臟缺血再灌注后內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)明顯增加，而在體采用ICAM1 抗體或ICAM1 表達(dá)缺失小鼠腎組織髓過氧化物酶活性增加受抑制,腎功能明顯緩解 10,11 。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)再灌注后24h腎臟ICAM-1表達(dá)明顯增強(qiáng)，且可見于腎小球毛細(xì)血管、系膜區(qū)及腎近曲小管上皮細(xì)胞，而正常

20、腎臟ICAM-1僅在腎髓質(zhì)直小血管、腎小管周圍毛細(xì)血管少量表達(dá)，在腎小管上皮不表達(dá)或少量表達(dá)12，13。輸注一定劑量的HES(130/0.4)能明顯抑制缺血再灌注損傷后ICAM1在大鼠腎臟的表達(dá)；腎臟功能和腎臟組織形態(tài)學(xué)都有明顯改善。缺血再灌注可激活腎臟內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，使粘附分子的表達(dá)升高，促進(jìn)白細(xì)胞在血管內(nèi)皮的附著；此外，活化的炎癥細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也可以激活補(bǔ)體系統(tǒng)，使局部組織炎癥介質(zhì)增加,如細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子( TNF) 、白介素( IL) 、血小板激活因子、花生四烯酸的代謝產(chǎn)物以及活性氧代謝產(chǎn)物等。這些炎癥因子又可以強(qiáng)化粘附分子表達(dá)和粘附力22。從而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞在局部聚集和粘附，

21、于外髓形成梗阻，白細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮通透性增加,紅細(xì)胞凝聚，導(dǎo)致再灌注后的腎臟外髓失灌注或灌注不足，而且浸潤(rùn)、激活的白細(xì)胞還可導(dǎo)致直接的組織損傷10 進(jìn)而造成器官功能損傷14 。HES(130/0.4)是一種天然的多糖，其不僅可以抑制內(nèi)皮損傷所致的ICAM1的表達(dá)，減少粘附分子的分泌，還可以通過直接抑制整合素介導(dǎo)的相互作用減輕白細(xì)胞的粘附15,16，同時(shí)也可以抑制缺血再灌注后內(nèi)皮細(xì)胞過度活化，下調(diào)全身炎癥反應(yīng)和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能17，從而發(fā)揮其抑制白細(xì)胞、血小板的粘附和激活，減輕毛細(xì)血管損傷所致的通透性增加，達(dá)到對(duì)腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。該點(diǎn)與Collis等人使用HES進(jìn)行的離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合

22、18。HES(130/0.4)雖能減輕腎組織缺血再灌注損傷，對(duì)腎功能恢復(fù)有促進(jìn)作用，但并不能完全阻斷其損傷，這也從另一側(cè)反映了腎臟缺血再灌注損傷機(jī)制多方面性。也有研究認(rèn)為HES(130/0.4)可以改善微循環(huán)，減少并帶走組織缺氧產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,增加組織供氧19，20。這在一定程度上也可以改善缺血再灌注后腎臟功能和組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。此外，輸注一定量的HES（130/0.4）可以稀釋血液，血液稀釋以后，腎皮質(zhì)血流增加，急性期的髓質(zhì)缺血腎臟髓質(zhì)滲透梯度下降，腎小管重吸收減少，尿量增加，沖洗了腎小管的內(nèi)毒素和可能形成的管形，從而保護(hù)了腎臟功能，改善長(zhǎng)期預(yù)后21。與S組相比，HES(130/0.4)5ml

23、/kg劑量組雖然在腎臟功能、組織形態(tài)以及ICAM1在腎臟的表達(dá)方面均有所改善，但是沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這可能與選擇的劑量小有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)只選擇了腎臟缺血再灌注后損傷比較嚴(yán)重的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行研究，沒有選擇多個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)觀察HES(130/0.4)對(duì)缺血再灌注損傷的影響以及與ICAM1表達(dá)的關(guān)系。總之，一定劑量的HES(130/0.4)可以明顯改善大鼠腎臟缺血再灌注損傷，抑制腎臟ICAM1表達(dá)和活性是其改善缺血再灌注損傷的可能機(jī)制之一。圖1. 大鼠皮質(zhì)腎小管（HE染色，1：400）。1A假手術(shù)組；1B生理鹽水組，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，變性與壞死，并見管型；1C HES 5ml/kg，1D HES 10m

24、l/kg，1E HES 20ml/kg，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性和壞死明顯減輕。 圖2. 大鼠皮質(zhì)腎小管ICAM-1表達(dá)（免疫組化，1：400）。1A假手術(shù)組；僅在腎髓質(zhì)直小血管、腎小管周圍毛細(xì)血管少量表達(dá)；1B生理鹽水組，表達(dá)明顯增強(qiáng)；1C HES 5ml/kg，1D HES 10ml/kg， 1E HES 20ml/kg，表達(dá)顯著少于S組。 參考文獻(xiàn)1 Bonventre JVMechanism of isehemic acute reDAtfailureJKidney In 1993，43：11601178 2 Rabh H, OMeara YM, Maderna P et al. Le

25、ukocytes, cell adhesion molecules and ischemic acte renal falure Kidney Int-I99751:1463-14683 Jie Tian, Xin Lin, Ren Guan, et al. The Effects of Hydroxyethyl Starch on Lung Capillary Permeability in Endotoxic Rats and Possible Mechanisms. Anesth Analg 2004;98:768744 Toback FGRegeneration after tubul

26、ar necrosisJKidney Im，1992，41：2262465 Kasper SM,Stromich A, Kampe S, et al. Evaluation of a new hydroxyethyl starch solution(130/0.4) in patients undergoing preoperative autologous blood donation. J Clin Anfesth 2001,Nov;13(7):486-906 Lckx BE, Bepperling F, Melot C et al.Plasma substitution effects

27、of a new hydroxyethyl starch HES (130/0.4) compared with HES (200/0.5) during and after extended acute normovolaemic haemoidlution. Br J Anaesth 2003,Aug;91(2):196-2027 Jungheinrich C,Scharpf R, Wargenau M et al. The pharmacyokinetics and tolerability of intravenous infusion of the new hydroxylethyl

28、 starch 130/0.4 in mild-to-severe renal impairment.Anesth Analg 2002, sep; 95(3):544-518 Brady HLeukocyte adhion rnolecul and kidey diseaseJKidn ey Int，1994，45：1285·12309 PM Lydyard, A Whelan, MW Fanger. Instant Notes in Immunology,2000:85-9210 Kelly KJ，Williams WW，Colvin RBIntercellular adhesi

29、on molecule-1 deficient mice are protected against ischemic renal injuryJ Clin Invest，1996，97(4)：1056106311 Kelly KJ，Williams WW，Colvin RBAntibody to intercellular adhesion molecule-1 protects the kidney against ischemic injuryProc Natl Acad Sci USA，l994-91(2)：812816 12 Minervini R. Cellular express

30、ion of lympbocytle function,associated antigen-1 and intercellular adhesion molecule-1 in normal kidney structures and in renal cancer. Eur Urol.1994;24:10313 Bear-P-C.Induction of RANTES,HLA-DR and intercellular adhesion molecule-1 on bighly purified distal tubular cells from buman kid-ney. Transpl

31、antation,2000;69(1):2456-9 14 Bounhoure J P, Galinier M, Assoun B et al. Inferior wall myocardial infarction and atrioventricular block; angiography and prognosis. Arch Mal Coeur Vaiss,1994,87:4452450.15 Weight SX, Bell PRF,Nicholson ML. Renal ischemic-reperfusion injury,Br J Surg, 1996,83:162-17016 B.Nohe，M Burchard, C Zanke et al. Endothelial Accumulation of Hydroxyethyl Starch and functional consequences on leukocyte-endothelial interactions.European surgical research 2002,34:364-37217 Rittoo D, Gosling P,Simms MH et al. The ef