熒光光譜分析講義03

1、理解分子熒光分析的基本原理理解激發(fā)光譜發(fā)射光譜 同步光譜 三維熒光光譜的含義掌握分子熒光發(fā)射光譜的特性了解熒光光譜儀器的組成及各部分作用掌握影響熒光強(qiáng)度的內(nèi)部結(jié)構(gòu)因素和外部環(huán)境因素了解光譜分析法的應(yīng)用范圍第一章 分子熒光光譜分析1概述分子熒光光譜分析也叫熒光分光光度法，是當(dāng)前普遍使用并有發(fā)展前途的一種光譜分析技術(shù)。物質(zhì)的分子吸收了紫外和可見(jiàn)光后它的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，然后以熱能的形式將這一部分能量釋放出來(lái)，本身回復(fù)到基態(tài)。如果吸收輻射能后處于電子激發(fā)態(tài)的分子以發(fā)射輻射的方式釋放這一部分能量，再發(fā)射的波長(zhǎng)可以同分子所吸收的波長(zhǎng)相同也可以不同，這個(gè)現(xiàn)象叫光致發(fā)光，最常見(jiàn)的光致發(fā)光現(xiàn)象是熒光和磷光。當(dāng)

2、用一種波長(zhǎng)的光照射某種物質(zhì)時(shí)，這個(gè)物質(zhì)會(huì)在極短的時(shí)間內(nèi)發(fā)射出比照射波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光，這種光稱(chēng)為熒光。對(duì)于熒光來(lái)說(shuō)，當(dāng)激發(fā)光停止照射后，發(fā)光過(guò)程幾乎立即（10-9-10-6 S）停止; 當(dāng)用一種波長(zhǎng)的光照射某種物質(zhì)時(shí)，這如果種物質(zhì)在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)發(fā)射出比照射波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光，這種光稱(chēng)為磷光。對(duì)于磷光來(lái)說(shuō)，當(dāng)激發(fā)光停止照射后，發(fā)光過(guò)程將持續(xù)一段時(shí)間（10-1-10 S）;磷光和熒光的發(fā)光機(jī)理是不同的。由于物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同，所吸收的光的波長(zhǎng)和發(fā)射的熒光波長(zhǎng)也有所不同，利用這個(gè)特性可以定性鑒別物質(zhì)。同一種分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)用同一波長(zhǎng)的激發(fā)光照射可以發(fā)射相同波長(zhǎng)的熒光，若該物質(zhì)的濃度不同，則濃度大時(shí)，所發(fā)射的熒光強(qiáng)度

3、也強(qiáng)，利用這個(gè)性質(zhì)可以進(jìn)行定量測(cè)定。用熒光進(jìn)行定性和定量的方法叫熒光分析法。2熒光分析的原理2.1分子熒光發(fā)生過(guò)程 2.1.1熒光與磷光2.1.1.1 分子的電子能級(jí)與激發(fā)過(guò)程分子除了電子不斷運(yùn)動(dòng)外，分子本身還有振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)。量子力學(xué)表明，這些運(yùn)動(dòng)的能量是量子化的，所以分子有電子能級(jí)，分子振動(dòng)能級(jí)，及分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。每個(gè)電子能級(jí)中有包含一系列的振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。.圖1 分子電子能級(jí)，振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)示意圖室溫下大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。處于基態(tài)的分子吸收能量（電能，熱能， 光能，化學(xué)能）后被激發(fā)為激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定將很快衰變?yōu)榛鶓B(tài)，若返回到基態(tài)伴隨著光子的輻射，這種現(xiàn)象稱(chēng)為發(fā)光?，F(xiàn)在

4、從分子結(jié)構(gòu)上討論熒光發(fā)光產(chǎn)生的機(jī)理。每個(gè)分子具有一系列嚴(yán)格分立的能級(jí)，稱(chēng)為電子能級(jí)。而每個(gè)電子能級(jí)中又包含者一系列振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。我們用S0 S1 Sn表示電子的基態(tài)，第一電子激發(fā)的單線態(tài)和第N電子激發(fā)的單線態(tài)。T1表示第一電子激發(fā)的三線態(tài)。電子激發(fā)的單線態(tài)和相應(yīng)的三線態(tài)的區(qū)別在于電子自旋方向不同，另外三線態(tài)的能級(jí)稍微低一些。電子能態(tài)的的多重性用M= 2S+1表示 , S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和，其數(shù)值為0或1。大多數(shù)分子含有偶數(shù)個(gè)電子?；鶓B(tài)時(shí)這些電子成對(duì)地填充在能量最低的各個(gè)軌道中。根據(jù)Pauli不相容原理,一個(gè)給定軌道中的兩個(gè)電子，必定具有相反方向的自旋，即自旋量子數(shù)分別為1/2和-1

5、/2，其總自旋量子數(shù)S=0，就是說(shuō)基態(tài)沒(méi)有凈自旋。分子的多重度M=1，該分子體系便處于單線態(tài)，用符號(hào)S表示。大多數(shù)有機(jī)物分子的基態(tài)是處于單線態(tài)的?；鶓B(tài)分子在吸收光能后其價(jià)電子從成鍵軌道或非成鍵軌道躍遷到高能量的反鍵軌道上，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)分子，此為分子光吸收過(guò)程。但是激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，通常很快失去能量回到基態(tài)。如果激發(fā)態(tài)分子在返回基態(tài)時(shí)以光輻射的形式失去能量，這種光輻射過(guò)程叫做光致發(fā)光。分子吸收能量后，如果電子在躍遷過(guò)程中不發(fā)生自旋方向的改變，這時(shí)分子處于激發(fā)的單線態(tài)。分子吸收能量后如果電子在躍遷過(guò)程中伴隨自旋方向的改變，這時(shí)分子便具有兩個(gè)自旋不配對(duì)的電子。即S=1，分子的多重度M= 2*1+1=3

6、，這時(shí)分子處于激發(fā)的三線態(tài)，用符號(hào)T表示。處于分立軌道上的非成對(duì)電子，平行自旋比成對(duì)自旋更穩(wěn)定些（洪特規(guī)則）。因此三線態(tài)的能級(jí)總是比相應(yīng)的單線態(tài)能級(jí)略低。 單線基態(tài) 激發(fā)單線態(tài) 激發(fā)三線態(tài) 圖 2 單線態(tài)和三線態(tài)2.1.1.2 熒光的產(chǎn)生 根據(jù)波滋曼分布(Boltzmann distribution ) 分子在室溫時(shí)基本上處于電子能級(jí)的基態(tài)，當(dāng)吸收了紫外可見(jiàn)光后，基態(tài)分子中的電子只能躍遷到激發(fā)單線態(tài)的各個(gè)不同振動(dòng)-轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)，根據(jù)自旋禁率, 不能直接躍遷到激發(fā)三線態(tài)的振動(dòng)-轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，它可能通過(guò)輻射躍遷和無(wú)輻射躍遷等多種分子內(nèi)去活化過(guò)程釋放多余的能量而返回基態(tài)，發(fā)射熒光

7、是其中途徑之一。下面幾種方式為基本去活化過(guò)程；振動(dòng)弛豫：(VR vibrational relaxation ) 在溶液中的物質(zhì)分子受入射光激發(fā)后形成的激發(fā)態(tài)分子，通過(guò)與溶劑分子碰撞，將部分能量傳遞給溶劑分子，其電子則返回同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。在這個(gè)過(guò)程中，分子被激發(fā)時(shí)吸收的能量不是以發(fā)出光輻射的形式耗散，因而屬于無(wú)輻射躍遷。振動(dòng)弛豫只能在同一電子能級(jí)進(jìn)行，所需時(shí)間約為10-8秒數(shù)量級(jí)。內(nèi)轉(zhuǎn)換：(IC Internal conversion): 指相同多重態(tài)電子能級(jí)中等能級(jí)間的一種無(wú)輻射躍遷過(guò)程。當(dāng)兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)之間能量相差較小，以至其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，則可能發(fā)生電子由高能級(jí)以無(wú)輻射躍

8、遷方式轉(zhuǎn)移到低電子能級(jí)的激發(fā)態(tài)。上述的振動(dòng)能級(jí)之間很接近時(shí)，內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換容易發(fā)生。外轉(zhuǎn)換（Ecexternal conversion）： 溶液中激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子及其他溶質(zhì)分子之間發(fā)生碰撞而消耗能量，所消耗的能量轉(zhuǎn)換為熱能。外轉(zhuǎn)換常發(fā)生在第一激發(fā)單線態(tài)或第一激發(fā)三線態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過(guò)程中。轉(zhuǎn)換時(shí)間為10-9-10-7秒，其發(fā)生可以降低熒光強(qiáng)度，這一現(xiàn)象叫熒光熄滅或猝滅。系間跨越 (Intersystem crossing, ISC)： 系間跨越指不同多重度狀態(tài)之間的一種無(wú)輻射躍遷過(guò)程。它涉及到受激電子自旋狀態(tài)的改變S1®T1，使原來(lái)兩個(gè)自旋配對(duì)的兩個(gè)電子不再配對(duì)，這種躍

9、遷是禁阻的，但如果兩個(gè)電子的能級(jí)的振動(dòng)能級(jí)有較大的重疊時(shí)，例如激發(fā)單線態(tài)S1的最低振動(dòng)能級(jí)與激發(fā)三線態(tài)T1的較高振動(dòng)能級(jí)重疊, 則可能通過(guò)自旋-軌道耦合等作用使S1態(tài)轉(zhuǎn)入T1態(tài)的某一振動(dòng)能級(jí).。系間跨越可以使熒光強(qiáng)度減弱或熄滅。熒光發(fā)射： （Fluorescence emission）.當(dāng)分子被激發(fā)到任意一個(gè)激發(fā)單線態(tài)，并通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換及振動(dòng)弛豫返回到第一激發(fā)單線態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)后， 再以輻射形式發(fā)射光量子并返回到基態(tài)的各個(gè)不同的振動(dòng)能級(jí)上，在這個(gè)過(guò)程中發(fā)射的光量子即稱(chēng)作熒光。由于從較高的激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)返回到第一激發(fā)單線態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)耗散了部分能量，熒光的能量小于激發(fā)光能量，所以發(fā)射熒光的波長(zhǎng)

10、比激發(fā)光的波長(zhǎng)要長(zhǎng)。發(fā)射熒光的過(guò)程約需10-910-7秒，電子返回到基態(tài)時(shí)可以停留在基態(tài)的任意振動(dòng)能級(jí)上，因此得到的熒光譜線有時(shí)呈現(xiàn)幾個(gè)互相靠近的峰。通過(guò)進(jìn)一步振動(dòng)弛豫，這些電子很快回到基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。根據(jù)kasha 規(guī)則，熒光多為S1®S0躍遷。熒光產(chǎn)生的過(guò)程和條件：熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光的過(guò)程可以分為4個(gè)步驟1 處于基態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的熒光物質(zhì)分子受到紫外線的照射，吸收了和它所具有的特征頻率相一致的光線，躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)；2被激發(fā)到第一電子激發(fā)態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)的分子，通過(guò)無(wú)輻射躍遷，返回到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)；3返回到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的分子繼續(xù)降

11、落到基態(tài)的各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)，同時(shí)發(fā)射出相應(yīng)的光量子，這就是熒光；4 到達(dá)基態(tài)的各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)的分子，再通過(guò)無(wú)輻射躍遷最后返回的基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。 磷光發(fā)射 激發(fā)態(tài)分子通過(guò)振動(dòng)弛豫下降到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)后，有可能經(jīng)過(guò)體系間跨越轉(zhuǎn)移到激發(fā)三線態(tài)的高振動(dòng)能級(jí)上。從單線態(tài)到三線態(tài)的分子系間跨越躍遷發(fā)生后，接著發(fā)生快速的振動(dòng)弛豫而達(dá)到三線態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)上。分子在三線態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)可以停留一段時(shí)間，然后發(fā)出光輻射躍遷至基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)，這種光輻射叫磷光。磷光與熒光的根本區(qū)別是熒光是由激發(fā)單線態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)至基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)間躍遷產(chǎn)生的。由于激發(fā)三線態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)比激發(fā)單線態(tài)的最低振動(dòng)

12、能級(jí)能量低，故磷光輻射的能量比熒光更小，亦即磷光的波長(zhǎng)比熒光更長(zhǎng)。從紫外光照射到發(fā)射熒光的時(shí)間約為10 8秒10 5秒，而發(fā)射磷光則更遲一些，約在照射后10 4秒10秒。 圖 2 熒光的產(chǎn)生2.1.2分子熒光的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜任何熒光化合物都有兩個(gè)特征光譜： 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，這是定性和定量分析的基本參數(shù)和依據(jù)。激發(fā)光譜：熒光是光致發(fā)光，因此必須選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)。這可由激發(fā)光譜曲線來(lái)確定。繪制激發(fā)光譜曲線時(shí)選擇熒光的最大發(fā)射波長(zhǎng)為測(cè)量波長(zhǎng)，改變激發(fā)光的波長(zhǎng)，測(cè)定熒光強(qiáng)度的變化。以激發(fā)光波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，即可得到熒光化合物的激發(fā)光譜。激發(fā)光譜的形狀與吸收光譜的形狀極為相似

13、，經(jīng)校正后的真實(shí)激發(fā)光譜與吸收光譜不僅形狀相同，而且波長(zhǎng)位置也一樣，這是因?yàn)槲镔|(zhì)分子吸收能量的過(guò)程就是激發(fā)過(guò)程。區(qū)別在于紫外吸收光譜測(cè)定對(duì)紫外光的的吸收度，而熒光激發(fā)光譜測(cè)定發(fā)射的熒光強(qiáng)度。發(fā)射光譜： 簡(jiǎn)稱(chēng)熒光光譜。將激發(fā)光波長(zhǎng)固定在最大激發(fā)波長(zhǎng)處，然后掃描發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)定不同發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度得到熒光發(fā)射光譜。圖3 是室溫下蒽在環(huán)己烷溶液中熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。從圖中可見(jiàn)在蒽的激發(fā)光譜中350nm 激發(fā)峰處有幾個(gè)小峰，這是由于吸收能量后由基態(tài)躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)中各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)引起的。在蒽的發(fā)射光譜中也有幾個(gè)小峰，這是由于蒽分子從激發(fā)態(tài)中各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)躍遷到基態(tài)中不同振動(dòng)能級(jí)發(fā)射出的熒

14、光量子的能量不同引起的。2.1.3熒光光譜的特征： 2.1.3.1 Stockes位移 在溶液熒光光譜中觀察到的熒光發(fā)射光波長(zhǎng)總是大于激發(fā)光波長(zhǎng)，Stockes 1852年首先觀察到這種波長(zhǎng)移動(dòng)現(xiàn)象，因而稱(chēng)之為Stockes位移。激發(fā)峰位和發(fā)射峰位的波長(zhǎng)差稱(chēng)為Stockes位移，它表示分子回到基態(tài)之前，在激發(fā)態(tài)壽命期間的能量消耗。用公式表示如下：?jiǎn)挝皇莄m-1Stockes位移=10 7(1/lex -1/lem) lex lem 分別為校正后的最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。Stockes位移說(shuō)明在激發(fā)和發(fā)射之間存在著一定能量損失，激發(fā)態(tài)分子通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)馳豫過(guò)程迅速到達(dá)第一激發(fā)單線態(tài)的最低振動(dòng)能

15、級(jí)，這是產(chǎn)生Stockes位移的主要原因。激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子的碰撞也造成能量損失，加大了Stockes位移。2.1.3.2熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)原因：熒光分子吸收了不同波長(zhǎng)的激發(fā)光后可被激發(fā)到不同能級(jí)，然后通過(guò)振動(dòng)弛豫和內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換, 最終都將回到第一激發(fā)單線態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，再發(fā)射熒光。因此熒光發(fā)射與熒光物質(zhì)的分子發(fā)射到哪個(gè)能級(jí)無(wú)關(guān)，即與激發(fā)能量無(wú)關(guān)。一般說(shuō)來(lái)， 熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)的選擇無(wú)關(guān)，激發(fā)電子都是從電子第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)，所以熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。2.1.3.3 熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜與激發(fā)光

16、譜存在著近似的“鏡像對(duì)稱(chēng)”關(guān)系。圖 3是蒽的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜圖.。 蒽的熒光激發(fā)光譜左邊灰色圖譜有一個(gè)a峰它是由分子吸收光后能后從基態(tài)S0躍遷到第二電子激發(fā)態(tài)S2形成的。在高分辨率的熒光光譜圖上可以觀察到B0 b1、b2、b3、b4 、等小峰組成的一蔟，他們分別由是由分子吸收光能后從基態(tài)S0躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)S1的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)形成的（見(jiàn)光譜圖上方與之對(duì)應(yīng)的能級(jí)示意圖）。各小峰間波長(zhǎng)遞減值Dl與振動(dòng)能級(jí)差DE有關(guān)，各個(gè)小峰的高度與躍遷幾率有關(guān)（b1的躍遷幾率最大，b0次之，b2、b3、b4依次遞減。蒽的熒光發(fā)射光譜（右邊黑色圖譜）同樣包含C0、C1、C2、C3、C4 一蔟小峰, 他們分別由分

17、子從第一電子激發(fā)態(tài)S1的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷至基態(tài)S0的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)發(fā)出光輻射形成的。由于電子基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分布與與激發(fā)態(tài)相似但不相同 , b1峰與 c1 峰b2峰與c2峰都是以 lb2 為中心基本對(duì)稱(chēng)。再加上C0、C1、C2、等峰的高度也與躍遷幾率有關(guān)，c1的躍遷幾率最大，c0次之，c2、c3、c4依次遞減.）因此形成了激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜的對(duì)稱(chēng)鏡像現(xiàn)象。2.2熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系是一個(gè)比較重要問(wèn)題，弄清他們之間的關(guān)系可以預(yù)示分子能否發(fā)生熒光，在什麼條件下發(fā)生熒光。這對(duì)研究分子熒光分析的應(yīng)用很有意義。2.2.1熒光壽命與熒光效率熒光壽命與熒光效率是熒光物質(zhì)重要的發(fā)光參數(shù)熒光

18、壽命Fluorescence life time)：當(dāng)除去激發(fā)光源后，分子的熒光強(qiáng)度降低到激發(fā)時(shí)最大熒光強(qiáng)度的1/e所需的時(shí)間稱(chēng)為熒光壽命。常用tf。表示。當(dāng)熒光物質(zhì)受到一個(gè)極短的光脈沖激發(fā)后，它從激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)的變化可用指數(shù)衰減規(guī)則表示：Ft=F0e-Kt. 式中F0， ，F(xiàn)t 分別是在激發(fā)開(kāi)始t=0和激發(fā)后時(shí)間 t 的熒光強(qiáng)度，K是衰減常數(shù)。假定在時(shí)間t=tf 測(cè)得得熒光強(qiáng)度 Ft 為F0 的1/e ，即Ft=1/e F0， 根據(jù)上述公式，1/e F0 = F0e-Ktf ， 由此得到1/e= e-Ktf Ktf=1，K=1/tf所以上述公式可以寫(xiě)成Ft= F0e-Ktf 或者 Ln F

19、0/Ft = t/tf如果以Ln F0/Ft對(duì)時(shí)間t作圖 ，直線斜率即為1/tf。由此可以計(jì)算出熒光壽命。利用分子熒光壽命的差別，可以進(jìn)行熒光混合物的分析。熒光效率（Fluorescence Efficiency）：又稱(chēng)為熒光量子產(chǎn)率(Fluorescencequantum yield)；是指激發(fā)態(tài)分子發(fā)射熒光的光子數(shù)與基態(tài)分子吸收激發(fā)光的光子數(shù)之比，它表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力。通常用下式表示jfjf = 發(fā)射熒光的光子/吸收激發(fā)光的光子= Kf/( Kf + Ki ) Kf 熒光發(fā)射過(guò)程的速率常數(shù)，Ki 為其他有關(guān)過(guò)程的速率常數(shù)之和。許多物質(zhì)并不發(fā)射熒光，因?yàn)樵诩ぐl(fā)態(tài)分子釋放激發(fā)能的過(guò)程中除了

20、熒光發(fā)射外，還有許多輻射和非輻射躍遷過(guò)程與之競(jìng)爭(zhēng)。 如果在受激分子回到基態(tài)過(guò)程中沒(méi)有其它去活化過(guò)程與熒光發(fā)射過(guò)程進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，那麼在這一段時(shí)間內(nèi)，所有激發(fā)態(tài)分子都將以發(fā)射熒光的方式回到基態(tài)，這一體系的熒光效率等于1。事實(shí)上，任何物質(zhì)的熒光效率不可能等于1，而是在01 之間。例如一些被作為熒光標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的9-氨基口丫啶（在水中），為0.99；蒽在乙醇中為0.30 ;硫酸奎寧二水化合物（在0.5 mol/l硫酸溶液中）為0.55。熒光效率低的物質(zhì)即使有較強(qiáng)的紫外吸收，所吸收的能量都以無(wú)幅射躍遷形式釋放，內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換的速度很快，所以沒(méi)有熒光發(fā)射。2.2.2分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系2.2.2.1物質(zhì)分子產(chǎn)生熒光

21、的條件物質(zhì)分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件；1物質(zhì)分子必須具有與照射的輻射頻率相適應(yīng)的吸收結(jié)構(gòu)，才能吸收激發(fā)光； 實(shí)驗(yàn)表明，分子結(jié)構(gòu)中含有p®p*躍遷或n®p*躍遷的化合物都有紫外可見(jiàn)吸收，但n®p*躍遷引起的R帶是弱吸收帶，電子躍遷幾率小，由此引起的熒光很弱。所以實(shí)際上只有分子結(jié)構(gòu)中存在p®p*躍遷，也就是K帶強(qiáng)吸收時(shí)才可能有熒光發(fā)生。2 吸收了與其本身特征頻率相同的能量后必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率。2.2.2.2分子結(jié)構(gòu)與熒光性質(zhì)熒光通常發(fā)生在具有共軛雙鍵體系的分子中。能產(chǎn)生熒光的分子都具有共軛雙鍵和大p鍵。長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)絕大多數(shù)熒光物質(zhì)都含有芳環(huán)或雜環(huán)，因

22、為具有這些結(jié)構(gòu)的分子具有長(zhǎng)共軛的p®p*躍遷。p電子的共軛程度越大，熒光強(qiáng)度越大，而熒光波長(zhǎng)也將紅移。如苯萘蕙三個(gè)化合物的共軛結(jié)構(gòu)與所發(fā)射的熒光的關(guān)系如下 ：苯 萘 蕙 lex 205nm 286 356lem 278 321 404 jf 0.11 0.29 0.36 除了芳香烴外，含有長(zhǎng)共軛雙鍵的的脂肪烴也可能有熒光，但這一類(lèi)化合物的數(shù)目不多。維生素A是能夠發(fā)射熒光的脂肪烴之一。分子的剛性和共平面性在同樣的長(zhǎng)共軛分子中，分子的剛性和共平面性越大，熒光效率越大，且熒光波長(zhǎng)產(chǎn)生長(zhǎng)移。例如，在相似的測(cè)定條件下，聯(lián)苯和芴的熒光效率分別為0.18 和1，芴的分子中亞甲基使其分子的剛性增加，

23、兩個(gè)苯環(huán)不能自由旋轉(zhuǎn)，共軛電子的共平面性增加，使芴的熒光效率大大增加。導(dǎo)致兩者的熒光性質(zhì)有顯著差別。 聯(lián)苯 芴 同樣情況還有酚酞和熒光素。他們分子中共軛雙健長(zhǎng)度相同，但熒光素分子中多一個(gè)氧橋，使分子中三個(gè)環(huán)成一個(gè)平面，隨著分子剛性和共平面性增加，p電子的共軛程度增加，因而熒光素有很強(qiáng)烈的熒光，而酚酞的熒光則很弱。不發(fā)生熒光或發(fā)生較弱熒光的物質(zhì)與金屬離子形成配位化合物后，如果剛性和共平面性增強(qiáng)，那麼就可以發(fā)生熒光或熒光增強(qiáng)。如 8-羥基喹啉是弱的熒光物質(zhì)，與鎂，鋁離子形成配位化合物后，熒光就增強(qiáng)。8-羥基喹啉 8-羥基喹啉鎂配合物如果原來(lái)結(jié)構(gòu)中共平面性較好，但分子中取代了較大的基團(tuán)，由于位阻的原

24、因使分子的共平面性下降，則熒光會(huì)減弱。例如：1-二甲氨基萘-8-磺酸鹽的jf = 0。03，而2-二甲氨基萘-8-磺酸鹽的jf = 0.75, 這是因?yàn)槎装被c磺酸鹽之間的位阻效應(yīng)，使分子發(fā)生了扭轉(zhuǎn)，兩個(gè)環(huán)共平面性變差，結(jié)果熒光減弱。 結(jié)構(gòu)式 結(jié)構(gòu)式2-二甲氨基萘-8-磺酸鈉 1-二甲氨基萘-8-磺酸鈉jf = 0.75 jf = 0.03 對(duì)于順?lè)串悩?gòu)體，順式分子的兩個(gè)基團(tuán)在同一側(cè)，由于位阻效應(yīng)使分子不能公平面而沒(méi)有熒光。例如 1，2 二苯乙烯的反式異構(gòu)體就有強(qiáng)烈熒光，而其順式異構(gòu)體就沒(méi)有熒光發(fā)射。取代基效應(yīng)熒光物質(zhì)分子上的各種取代基對(duì)分子的熒光光譜和熒光強(qiáng)度都會(huì)產(chǎn)生很大的影響。取代基可以

25、分為3類(lèi)：第一類(lèi)取代基 為給電子基團(tuán)：包括 OH、 OR、 NH2、 CN、 NR2等使熒光增強(qiáng)。這是因?yàn)楫a(chǎn)生了Pp共軛作用，增強(qiáng)了p電子的共軛程度，使最低激發(fā)三線態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率加大的緣故。第二類(lèi)取代基 為吸電子基團(tuán)：如 COOH， C=O， NO2, NO, SH , NHCOCH3, Cl, Br,I ，由于減弱了分子p電子的共軛程度，從而減弱甚至猝滅熒光。第三類(lèi)取代基：對(duì)電子的共軛作用較小對(duì)熒光影響不明顯。如R SO3H， NH3 。表1 列出了部分取代基對(duì)苯的熒光效率和強(qiáng)度的影響.表 1 苯環(huán)取代基在乙醇溶液中的熒光相對(duì)強(qiáng)度化合物 分子式 熒光波長(zhǎng) 熒光相對(duì)強(qiáng)度苯 C6H6 2

26、70-310 10甲苯 C6H5CH3 270- 320 17 丙基苯 C6H5C3H7 270- 320 17 氟代苯 C6H5F 270-320 10 氯代苯 C6H5Cl 275-345 7 溴代苯 C6H5Br 290-380 5 碘代苯 C6H5I - 0苯酚 C6H5OH 285-365 18 酚離子 C6H5O+ 310-400 10 苯甲醚 C6H5O- 285-345 20苯胺 C6H5 NH2 310-405 20苯胺離子 C6H5NH3+ - 0苯甲酸 C6H5 COOH 310-390 3苯基氰 C6H5CN 280-360 20硝基苯 C6H5NO2 - 0 - 取代

27、基位置對(duì)應(yīng)光強(qiáng)度有影響。對(duì)芳烴而言，一般鄰位對(duì)位取代基增強(qiáng)熒光。間位取代基抑制熒光（CN例外）。當(dāng)取代基存在使共軛增加時(shí)，取代基影響下降。當(dāng)兩個(gè)取代基共存，可能其中一個(gè)起主導(dǎo)作用。重原子取代基存在如I- 則會(huì)使熒光減弱。這是因?yàn)橹卦拥拇嬖?，使熒光體的電子自旋-軌道耦合作用加強(qiáng)，S1 ® T1間的跨越顯著增強(qiáng)的緣故。2.3影響熒光強(qiáng)度的外部因素分子所處的外界環(huán)境如溫度、溶劑、酸度、熒光猝滅劑等，都能影響熒光效率，甚至影響分子結(jié)構(gòu)及立體構(gòu)象，從而影響熒光光譜的的形狀和強(qiáng)度。了解和利用這些因素的影響，有助于提高熒光分析的靈敏度和選擇性。2.3.1 溫度溫度對(duì)熒光強(qiáng)度影響敏感。在一般情況下

28、，隨著溫度的升高，溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率和熒光強(qiáng)度將降低。因?yàn)楫?dāng)溫度升高時(shí)分子運(yùn)動(dòng)速度加快，分子間碰撞幾率增加，使無(wú)輻射躍遷增加，從而降低了熒光強(qiáng)度。例如熒光素鈉的乙醇溶液在零度以下溫度每下降10度，jf增加3%，在零下80度時(shí)jf接近1。2.3.2溶劑溶劑的影響分為一般溶劑效應(yīng)和特殊溶劑效應(yīng)。一般溶劑效應(yīng)指溶劑的折射率和介電常數(shù)的影響 。特殊溶劑效應(yīng)指熒光體和溶劑分子之間的特殊化學(xué)作用，如氫健的形成和化合作用。一般溶劑效應(yīng)是普遍的，而特殊溶劑效應(yīng)則取決于溶劑和熒光體的化學(xué)結(jié)構(gòu).。特殊溶劑效應(yīng)大于一般溶劑效應(yīng)的影響。同一熒光物質(zhì)在不同溶劑中，其熒光光譜形狀和強(qiáng)度都有差別。一般情況下，熒光波長(zhǎng)

29、隨溶劑的極性增大而紅移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。因?yàn)樵跇O性溶劑中，p®p*躍遷所需的能量差DE減少，而且躍遷幾率增加，從而使紫外吸收波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)均紅移，熒光強(qiáng)度增大。溶劑粘度減少，分子碰撞機(jī)會(huì)增加使無(wú)輻射躍遷增加 而熒光減弱，故熒光強(qiáng)度隨溶液的黏度降低而減弱。一般溫度上升，溶劑黏度變小，因此溫度上升熒光強(qiáng)度下降。2.3.3溶液的pH當(dāng)熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的酸度對(duì)熒光物質(zhì)分子的熒光強(qiáng)度有較大的影響。這是因?yàn)槠浞肿咏Y(jié)構(gòu)和離子結(jié)構(gòu)是不同的，它們的電子構(gòu)型不同，在不同的酸度條件下分子和離子之間的平衡發(fā)生改變，因此熒光強(qiáng)度發(fā)生改變 。每一種熒光物質(zhì)的分子都有其最適宜的發(fā)射熒光的存在形式，即

30、最適宜的pH 范圍 。在pH 7-12 的溶液中， 苯胺以分子形式存在，會(huì)發(fā)生蘭色熒光，但在pH2 或 13的溶液中苯胺以離子形式存在不發(fā)生熒光。金屬離子與有機(jī)試劑形成的發(fā)光螯合物也受溶液pH值的影響。一方面pH值會(huì)影響螯合物的形成，另一方面也影響螯合物的組成，因而影響他們的熒光性質(zhì)。例如鎵與2，2二羥基偶氮苯在pH 3-4的溶液中形成1：1的螯合物，能發(fā)射熒光。而在pH 6-7的溶液中則形成非熒光性的1：2型螯合物。2 3 4溶液熒光的猝滅 熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象叫熒光猝滅。能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)叫猝滅劑。熒光猝滅的形式：碰撞猝滅：是熒光猝滅的

31、主要類(lèi)型。處于激發(fā)單線態(tài)的熒光分子M*與猝滅劑分子Q相碰撞，使熒光分子以無(wú)輻射躍遷的形式回到基態(tài)，產(chǎn)生猝滅作用。這一過(guò)程可以表示如下：碰撞猝滅 M+ hn ® M* ®M+hn (發(fā)生熒光)®M (非輻射猝滅)®M+Q （碰撞猝滅） 靜態(tài)猝滅： 由于部分熒光物質(zhì)分子M與猝滅劑分子Q 生成了本身不發(fā)生熒光的的配位化合物而產(chǎn)生。這一過(guò)程往往還會(huì)引起溶液吸收光譜的改變。轉(zhuǎn)入三線態(tài)猝滅：在熒光物質(zhì)分子中，引入溴和碘后易發(fā)生體系間跨越，而轉(zhuǎn)變?yōu)槿€態(tài)。轉(zhuǎn)變?yōu)槿€態(tài)的分子在常溫下不發(fā)光，他們?cè)谂c其它分子碰撞中消耗能量而引起熒光猝滅。溶解氧引起的熒光猝滅：溶解氧的存在

32、使熒光物質(zhì)氧化，或者由于氧分子的順磁性，促進(jìn)了熒光物質(zhì)激發(fā)態(tài)分子體系間跨越躍遷，使激發(fā)單線態(tài)的熒光分子轉(zhuǎn)變至三線態(tài)，從而引起熒光熄滅。 發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的熒光猝滅：某些猝滅劑分子與熒光物質(zhì)分子相互作用發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，引起熒光猝滅。如甲基藍(lán)溶液的熒光被Fe2+ 離子猝滅就是這種情況。其他的I- 、Br、 CNS- 、S2O32- 等易給出電子的陰離子，對(duì)奎寧，羅丹明及熒光素鈉的物質(zhì)的熒光也會(huì)發(fā)生猝滅作用。熒光物質(zhì)的自猝滅：在濃度較高的熒光物質(zhì)溶液中往往會(huì)發(fā)生自猝滅現(xiàn)象。其原因是單線激發(fā)態(tài)的分子在發(fā)生熒光之前和未激發(fā)的熒光分子碰撞引起自熄滅，如蒽和苯。有些熒光物質(zhì)分子在溶液濃度高時(shí)會(huì)形成二聚體

33、或多聚體，使其吸收光譜發(fā)生變化，也引起溶液熒光強(qiáng)度的降低或消失。解決方法： 稀釋樣品； 標(biāo)準(zhǔn)加入法。Stop 2.3.5散射光的干擾當(dāng)一束平行光照射在液體樣品上，大部分光線透過(guò)溶液，小部分由于光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變而向不同角度散射，這種光稱(chēng)為散射光。 瑞利散射：當(dāng)光子和物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞時(shí)，不發(fā)生能量交換，僅僅是光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變，這種散射叫瑞利散射光。其波長(zhǎng)與入射光波長(zhǎng)相同。 拉曼散射：光子和物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞時(shí)，在光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變的同時(shí)，光子與物質(zhì)分子發(fā)生能量交換。光子把部分能量轉(zhuǎn)給物質(zhì)分子后，在一定條件下，分子所獲得的能量使得圍繞其中某一健分布的電子

34、云產(chǎn)生瞬時(shí)彈性變形，這時(shí)輻射能量暫時(shí)保留在變形的極化分子的一個(gè)虛態(tài)上。這個(gè)虛態(tài)并不存在常規(guī)電子能級(jí)圖中，電子在那里只能保持10-15-10-14秒時(shí)間，隨后回到其電子能態(tài)基態(tài)的不同振動(dòng)能級(jí)上，發(fā)射出比入射波長(zhǎng)長(zhǎng)或稍短的光，稱(chēng)為拉曼光。散射光對(duì)熒光測(cè)定有干擾，尤其是波長(zhǎng)比入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的拉曼光，因?yàn)橐话阃瑫r(shí)產(chǎn)生的多條拉曼輻射線，可以復(fù)合成一個(gè)覆蓋一定波長(zhǎng)范圍的較寬的帶，如果這種輻射帶正好和熒光輻射的波長(zhǎng)相近，就會(huì)對(duì)熒光測(cè)定產(chǎn)生干擾。因此在熒光測(cè)定中必須采取措施避免這種干擾。選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)可以消除拉曼光的干擾。以硫酸奎寧為例。從圖4可見(jiàn)，無(wú)論選320nm或者350nm 為激發(fā)光,熒光峰總是在4

35、48 nm。分別在320nm和350nm激發(fā)光下測(cè)定空白溶劑的發(fā)射光譜， （這種情況下并沒(méi)有發(fā)生熒光發(fā)射，得到的是拉曼散射光）。從圖b 可見(jiàn)， 當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為320 nm 時(shí)瑞利光波長(zhǎng)是320 nm ，拉曼光波長(zhǎng)是360 nm ，拉曼光對(duì)熒光無(wú)影響；。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm 時(shí)瑞利光波長(zhǎng)是350 nm ，拉曼光波長(zhǎng)是 400 nm ，拉曼光對(duì)熒光有干擾，因而影響測(cè)定結(jié)果。圖4 硫酸奎寧在不同波長(zhǎng)激發(fā)下的熒光與散射光譜水， 乙醇，環(huán)己烷，四氯化碳，氯仿這5種溶劑是最常用的溶劑，他們自身都能發(fā)射拉曼散射光，從而可能干擾熒光測(cè)定。表2 列出了不同波長(zhǎng)激發(fā)光照射下的拉曼輻射波長(zhǎng)，可供選擇激發(fā)波長(zhǎng)或溶劑

36、時(shí)參考。表2 不同波長(zhǎng)激發(fā)光下主要溶劑的拉曼光波長(zhǎng)溶劑 激發(fā)波長(zhǎng) 248 313 365 405 436 - 水 271 350 416 469 511 乙醇 267 344 409 459 500 環(huán)己烷 267 344 408 458 499四氯化碳 - 320 375 418 450氯仿 - 346 410 461 502 2.3.6 內(nèi)濾光作用和自吸收現(xiàn)象 溶液中如果存在著能吸收激發(fā)或熒光物質(zhì)所發(fā)射的光能的物質(zhì)，就會(huì)使熒光減弱，這種現(xiàn)象稱(chēng)為“內(nèi)濾光作用“。例如在1ng/ml的色氨酸溶液中如果有重鉻酸鉀存在，由于在色氨酸的激發(fā)和發(fā)射峰附近正好是重鉻酸鉀的兩個(gè)吸收峰，吸收了色氨酸的激發(fā)能和

37、色氨酸發(fā)射的熒光，使測(cè)得的色氨酸熒光大大降低。內(nèi)濾光作用的另一種情況是熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜短波長(zhǎng)一端與與該物質(zhì)的吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)的一端有重疊。在溶液濃度較大時(shí)一部分熒光發(fā)射被自身吸收，產(chǎn)生所謂自吸收現(xiàn)象，降低了溶液的熒光強(qiáng)度。3定量分析方法3.1強(qiáng)度與濃度的關(guān)系由于熒光物質(zhì)是在吸收光能被激發(fā)之后才發(fā)射熒光的，因此溶液的熒光強(qiáng)度與該溶液中熒光物質(zhì)吸收光能的程度以及熒光效率有關(guān)。溶液中熒光物質(zhì)被入射光（I0）激發(fā)后可以在溶液的各個(gè)方向觀察熒光強(qiáng)度（F）。.但由于激發(fā)光有部分透過(guò)（I），這部分透過(guò)的入射光會(huì)干擾對(duì)熒光的測(cè)定，因此應(yīng)該在與激發(fā)光源垂直的方向進(jìn)行測(cè)定。設(shè)溶液中熒光物質(zhì)的濃度為C，液層厚

38、度為L(zhǎng)，熒光強(qiáng)度F正比于被熒光物質(zhì)吸收的光強(qiáng)度，即：F µ (I0 It) ，F(xiàn) µ IaF= K Ia, 公式中K為常數(shù), 其數(shù)值取決于熒光效率。根據(jù)Lambert Beer定律Ia= I0 It=I0 (110-ECL) = I0 (1e -2.3ECL)e -2.3ECL =1+ (-2.3ECL)1/1! +(-2.3ECL)2/2!+(-2.3ECL)3/3! +(-2.3ECL)4/4!+.若濃度很小，ECL值也很小，ECL<0.05時(shí) ，式中第二項(xiàng)以后的各項(xiàng)可以省略，于是e -2.3ECL =1 2.3ECL F = K Ia = K I0 (1e -2

39、.3ECL)= 2.3 K I0 ECL 當(dāng)入射光光強(qiáng)度和液層厚度一定，上式簡(jiǎn)寫(xiě)為F= KC 在低濃度時(shí)溶液的熒光強(qiáng)度與溶液中熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系。熒光分析方法定量的依據(jù)是熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度的線性關(guān)系，而熒光強(qiáng)度的靈敏度取決于檢測(cè)器的靈敏度，即只要改進(jìn)光電倍增管和放大系統(tǒng)使極弱的熒光也能被檢測(cè)到，可以測(cè)定很稀的溶液的濃度，因此熒光分析法的靈敏度很高。3.2定量分析方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法：濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，在同樣實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定樣品溶液。在繪制工作曲線時(shí)常采用系列中某一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液作為基準(zhǔn)，將空白溶液的熒光強(qiáng)度讀數(shù)調(diào)到0% 將該標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度調(diào)到100%或50%。在實(shí)

40、際工作中當(dāng)儀器調(diào)零之后先測(cè)定空白溶液的熒光強(qiáng)度，然后再測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度, 從后者減去前者即可, 然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。為了使在不同時(shí)間所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠一致，在每次繪制曲線時(shí)均采用同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)儀器進(jìn)行校正。如果試樣在紫外光下不穩(wěn)定，可以改用另一種穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為基準(zhǔn)，只要其熒光峰和試樣溶液的熒光峰相近似，例如測(cè)定維生素B1時(shí)，可采用硫酸奎寧作為基準(zhǔn)。在使用工曲線法定量時(shí)須注意熒光分析所用的試劑標(biāo)準(zhǔn)品一定要純，樣品池要清潔。被分析的樣品不能用激發(fā)光長(zhǎng)時(shí)間照射，以免熒光物質(zhì)發(fā)生分解。標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品溶液應(yīng)該在同一條件進(jìn)行測(cè)定熒光強(qiáng)度。熒光猝滅法； 在一般熒光分析方法中一些熒光猝滅劑應(yīng)該事先分

41、離。但也可以利用猝滅現(xiàn)象用于熒光分析。若某一物質(zhì)本身不會(huì)發(fā)射熒光，也不與其他物質(zhì)形成熒光物質(zhì)，但他們會(huì)使另一種發(fā)射熒光的物質(zhì)熒光強(qiáng)度下降，下降程度與該物質(zhì)的濃度成比例，以次建立的熒光分析方法叫熒光猝滅法。例如氟離子會(huì)使鋁-八羥基喹啉洛和物的熒光強(qiáng)度下降，在適當(dāng)條件下熒光強(qiáng)度與氟離子的濃度成反比例，可用于痕量氟的測(cè)定。動(dòng)力學(xué)熒光分析法化學(xué)反應(yīng)時(shí)其中反應(yīng)物或產(chǎn)物中有熒光物質(zhì)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，因?yàn)闈舛茸兓馃晒鈴?qiáng)度隨時(shí)間的變化，可以求出物質(zhì)的含量，以此建立動(dòng)力學(xué)熒光分析法。例如Fe(III) pH=3.4時(shí)，1，4二氨基-2，3二氫蒽醌（A）與其發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生深綠色熒光產(chǎn)物（B）, (le

42、x =400nm, lem= 470nm), 反應(yīng)式Fe(III) + H+ +A Fe(II) + B 當(dāng)pH值一定時(shí)dB/dt = hA Fe(III)式中t 為時(shí)間； h為比例常數(shù)。在反應(yīng)初期可以認(rèn)為A不變，并對(duì)上式進(jìn)行積分，則B= h¢ Fe(III)t又由于IFB = kB， 公式中IFB為熒光物質(zhì)的發(fā)射強(qiáng)度，則有IFB = h² Fe(III) t或 IFB /t= h² Fe(III)通過(guò)測(cè)量不同F(xiàn)e(III)下的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度，由Fe(III)對(duì)IFB /t作圖，得到工作曲線。如果有些化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物雖能夠產(chǎn)生熒光但反應(yīng)進(jìn)行緩慢，而在加入某些微量金屬離

43、子的催化作用下，反應(yīng)速率加快，熒光強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，那麼反應(yīng)速率與該痕量金屬離子濃度存在著定量關(guān)系，以此可以測(cè)量作為催化劑的痕量金屬，此法成為催化熒光測(cè)定方法。 直接比較法 也叫比例法。如果熒光分析方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)原點(diǎn)，就可以選擇其線性范圍，用比例法進(jìn)行測(cè)定。取一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液使其濃度在線性范圍內(nèi),測(cè)定其熒光強(qiáng)度Fs。之后在同樣條件下測(cè)定試樣溶液的熒光強(qiáng)度Fx， 然后計(jì)算物質(zhì)的含量?？瞻兹芤旱臒晒鈴?qiáng)度調(diào)不到0%，必須從標(biāo)準(zhǔn)和試樣的值扣除空白溶液的熒光強(qiáng)度F0，然后計(jì)算。Fs F0 =K CsFx F0 =K Cx對(duì)于同一熒光物質(zhì)，常數(shù)K相同（Fs F0 ）/（Fx F0）= Cs /CxCx =（F

44、x F0）/（Fs F0 ）* Cx多分混合物分析.:如果不同組分的熒光光譜相互重疊可以考慮利用熒光強(qiáng)度的加合性質(zhì)在適宜的波長(zhǎng)處測(cè)定混合物的熒光強(qiáng)度，再根據(jù)被測(cè)各個(gè)組分的各自在適當(dāng)?shù)臒晒獠ㄩL(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度 列聯(lián)立方程求出各自含量。導(dǎo)數(shù)熒光光譜分析法也叫微分熒光光譜分析法，用物質(zhì)熒光強(qiáng)度對(duì)對(duì)其熒光波長(zhǎng)的導(dǎo)數(shù)值與其對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)作圖可得導(dǎo)數(shù)熒光光譜。 dI/dl l 曲線 一階導(dǎo)數(shù)熒光光譜隨著導(dǎo)數(shù)階數(shù)的增加，熒光峰的尖銳程度增大，帶寬減少，分辨率提高。將靠的很近的，重疊的熒光峰分別開(kāi)來(lái)，還可以清楚地辨認(rèn)陡坡上的弱小峰肩蜂，寬峰可以準(zhǔn)確給出峰位。提供更多的結(jié)構(gòu)信息，用于定性。用熒光導(dǎo)數(shù)值與樣品濃度值呈線性關(guān)

45、系可以用導(dǎo)數(shù)熒光光譜分析法定量。4熒光分析方法的特點(diǎn)靈敏度高 與紫外可見(jiàn)分光光度法法比較,熒光是從與入射光成直角方向檢測(cè)，即在黑背景下（有很小的噪聲背景）檢測(cè)熒光發(fā)射信號(hào)。所以可以用增強(qiáng)入射光強(qiáng)度或增大熒光放大倍數(shù)來(lái)提高靈敏度；在吸收光度法中不但要測(cè)定透過(guò)試樣的光強(qiáng)度I，還要測(cè)量入射光強(qiáng)度I0. 當(dāng)試樣濃度很低，吸收微弱，I 和I0非常接近，檢測(cè)器很難區(qū)分兩個(gè)較大信號(hào)之間的微小差別。此外在分光光度法中如果增加入射光強(qiáng)度I0，I也按比例變化，若提高檢測(cè)器信號(hào)的放大倍數(shù)，其放大作用I0和I是同樣的。因此熒光分析的靈敏度要比分光光度法光高2-4個(gè)數(shù)量級(jí)。測(cè)定下限在0.1-0.001ng/ml之間。紫

46、外可見(jiàn)分光光度法的靈敏度為10-7g/ml 而熒光光度法測(cè)定的靈敏度在 10-10 10-12g/ml之間。選擇性好 既可根據(jù)特征發(fā)射又可以根據(jù)特征吸收來(lái)鑒定物質(zhì)。如果某幾個(gè)物質(zhì)的發(fā)射光譜相似，可以從其激發(fā)光譜的差異將其區(qū)分開(kāi)來(lái)。而如果他們的吸收光譜相同，則使用發(fā)射光譜將其區(qū)分。所需樣品量少，方法簡(jiǎn)便提供較多的物理參數(shù) 可以提供激發(fā)光譜，發(fā)射光譜，熒光強(qiáng)度，熒光效率，熒光壽命，熒光偏振等參數(shù)，可以從不同角度反映熒光物質(zhì)分子的各種特性，并通過(guò)這些物理參數(shù)得到被研究的物質(zhì)的更多的信息。缺點(diǎn) 應(yīng)用范圍不夠廣泛，本身能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)較少，加入某種試劑經(jīng)衍生化后才能測(cè)定的物質(zhì)也不是很多。由于熒光分析的

47、靈敏度高，測(cè)定時(shí)對(duì)環(huán)境因素敏感，干擾因素較多。如溫度 溶劑，酸度，散射光等。5 熒光分析儀51 儀器組成用于熒光測(cè)定的儀器由以下四個(gè)部件組成： 激發(fā)光源；樣品池，單色器，檢測(cè)器（圖 5）。由光源發(fā)出的光經(jīng)過(guò)第一單色器得到所需要的激發(fā)光波長(zhǎng)，激發(fā)光通過(guò)樣品池，熒光物質(zhì)被激發(fā)后發(fā)射熒光。為了消除入射光和散射光的影響通常在與激發(fā)光垂直的方向上測(cè)定熒光。為了消除可能存在的其他光的干擾，如激發(fā)光產(chǎn)生的反射光，瑞利散射光和拉曼散射以及溶液中雜質(zhì)產(chǎn)生的熒光，以便獲得所需要的熒光，在樣品池和檢測(cè)器之間設(shè)置了第二個(gè)單色器，熒光作用于檢測(cè)器上，記錄相應(yīng)的電信號(hào)。經(jīng)過(guò)放大被記錄下來(lái)。圖5 熒光光度計(jì)基本組成框圖圖6

48、 F-4500熒光光度計(jì)光路圖激發(fā)光源 在紫外可見(jiàn)光范圍， 常用的光源是高壓氙燈和高壓汞燈。氙燈內(nèi)裝有氙氣，氙燈發(fā)射的光譜強(qiáng)度大，而且是連續(xù)光譜分布在200-700nm 范圍內(nèi)，并且在300-400 波長(zhǎng)之間的強(qiáng)度幾乎相等。目前大多數(shù)熒光計(jì)使用它作光源。高壓氙燈是一種氣體放電燈，外套為石英，內(nèi)充氙氣，室溫下壓力0.5Mpa (5 atm) ，工作時(shí)壓力為2Mpa (20 atm)。氙燈內(nèi)充氣總是處于高壓狀態(tài)先燈壽命約為2000小時(shí)，在安裝或更換時(shí)要戴上防護(hù)鏡或者嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行以便防止以外發(fā)生。由于氙燈的啟動(dòng)電壓在 20-40 KV，不僅人體要注意安全，在儀器配有計(jì)算機(jī)是，應(yīng)先點(diǎn)著氙燈帶穩(wěn)

49、定后再開(kāi)計(jì)算機(jī)。 樣品池 液體樣品池通常用石英材料制成，形狀以方型或者長(zhǎng)方形為好，因?yàn)檫@種形狀散射光干擾較少。固體樣品用可用樣品架。單色器 包括色散元件和狹縫。較高級(jí)的單色器采用光柵。其優(yōu)點(diǎn)是在所有波長(zhǎng)都能夠色散而且色散均勻，有相同的分辨率。入射光的80%能量在一級(jí)光譜中。第一單色器用于選擇所需要的激發(fā)波長(zhǎng)第二單色器用于分離出熒光發(fā)射波長(zhǎng)。狹縫關(guān)系到單色器分辨率的優(yōu)劣， 用于控制譜帶寬度和光強(qiáng)度。一般說(shuō)來(lái)，狹縫越窄單色性越好。但光強(qiáng)隨之減小而降低靈敏度。在實(shí)際使用時(shí)應(yīng)該兩者兼顧。檢測(cè)器要求有較高的靈敏度，一般應(yīng)用光電倍增管作檢測(cè)器。52儀器的校正靈敏度校正 熒光光度計(jì)的靈敏度可以用被檢測(cè)出的最

50、低信號(hào)來(lái)表示，通常以硫酸奎寧的檢出限或者以純水的的拉曼峰的信噪比（S/N）表示。熒光光度計(jì)的靈敏度與光源強(qiáng)度，單色器（包括透鏡，反射鏡）的性能，放大系統(tǒng)的特征，和光電倍增管的靈敏度有關(guān)；與所選用的波長(zhǎng)，狹縫寬度有關(guān)。與被測(cè)空白溶劑的拉曼散射，激發(fā)光，雜質(zhì)熒光有關(guān)。由于影響因素多，同一型號(hào)的儀器，甚至同一臺(tái)儀器在不同時(shí)間操作，所測(cè)得的結(jié)果也不盡相同。因而在每次測(cè)定時(shí)，在選定波長(zhǎng)和狹縫寬度的條件下，先用一種熒光性質(zhì)穩(wěn)定，濃度固定的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行校正，將每次所測(cè)得的熒光強(qiáng)度調(diào)整到相同數(shù)值（50%或100%）。如果被測(cè)定的物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光很穩(wěn)定，自身就可以作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。紫外可見(jiàn)范圍內(nèi)最常用的是1mg/ml

51、（0.05mol/l 硫酸中）硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液。因?yàn)槠洚a(chǎn)生的熒光十分穩(wěn)定。波長(zhǎng)校正 熒光分光光度計(jì)的波長(zhǎng)出廠前都經(jīng)過(guò)了校正，若儀器的光學(xué)系統(tǒng)和檢測(cè)器有所變動(dòng)，或較長(zhǎng)時(shí)間使用后，或在重要部件更換后，有必要用汞燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線對(duì)單色器刻度重新校正，這一點(diǎn)在要求較高的測(cè)定工作中尤為重要。激發(fā)光譜和熒光光譜的校正 熒光分光光度計(jì)所測(cè)得的激發(fā)光譜或熒光光譜往往隨著儀器不同而不同。原因：?jiǎn)紊鞑ㄩL(zhǎng)的準(zhǔn)確度，拉曼散射光的影響，以及狹縫寬度等。其最主要的原因有光源的強(qiáng)度隨波長(zhǎng)變化 ，檢測(cè)器對(duì)不同波長(zhǎng)光的接受敏感程度不同，檢測(cè)器的響應(yīng)與光強(qiáng)不成線性。由于以上原因，在用單光束儀器測(cè)定激發(fā)和發(fā)射光譜時(shí)，因?yàn)椴荒苡脜⒈热?/p>

52、液進(jìn)行相對(duì)校正，誤差較大。尤其是當(dāng)波長(zhǎng)處于檢測(cè)器靈敏度曲線的陡坡時(shí)得到的“表觀光譜”中的值之間的相對(duì)關(guān)系不能反映真實(shí)情況，產(chǎn)生了顯著誤差。因此可先用儀器上附有的校正裝置將每一個(gè)波長(zhǎng)的光源強(qiáng)度調(diào)整到一致，然后根據(jù)表觀光譜每一個(gè)波長(zhǎng)的強(qiáng)度除以檢測(cè)器對(duì)每一個(gè)波長(zhǎng)的感應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行校正以消除誤差。目前生產(chǎn)的光度計(jì)大都是雙光束光路，可以用參比光束抵消誤差。5.3 熒光分析儀器的維護(hù)要正確提供主機(jī)及附件所需的供電電壓和頻率，不可接錯(cuò)電源。拿燈時(shí)不要碰窗口，如果不小心碰觸，及時(shí)用無(wú)水乙醇擦凈，燈源不穩(wěn)定或強(qiáng)度太弱而影響測(cè)定時(shí)，應(yīng)換燈；不要用肉眼直視燈源，以免損傷眼睛。單色器不得輕易拆卸，保持內(nèi)部干燥，以防色散元件和反射鏡受潮。放樣品池時(shí)要固定一個(gè)方向，免得液池各透光面被池架的彈簧片擦壞，增加散射。液池要洗凈，不得留有痕跡影響測(cè)定。新的液池常常掛水，可用3mol/l 鹽酸和50%乙醇等量混合液浸泡。保持光電倍增管室干燥，保證絕緣良好，光電倍增管通電后避免不必要的爆光 要養(yǎng)成隨時(shí)關(guān)閉光閘的習(xí)慣，以免損壞光電倍增管，或因?yàn)椤捌凇苯档挽`敏度。5.4 熒光測(cè)定物理?xiàng)l件的選擇熒光測(cè)定可變因素比較多，只有選好條件才能獲得滿意的激發(fā)和發(fā)射光譜