肝硬化門靜脈高壓癥患者肝組織α1腎上腺素受體亞型的mRNA表達(dá)

1、    肝硬化門靜脈高壓癥患者肝組織 1腎上腺素受體亞型的mRNA表達(dá)        【摘要】目的探討肝硬化門靜脈高壓癥患者肝組織1腎上腺素受體(1AR)亞型mRNA的表達(dá)情況。方法應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)12例乙型肝炎后肝硬化肝組織和15例正常肝臟組織中1 AR亞型mRNA的表達(dá)。同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增1 AR亞型特異性片段和內(nèi)參片段，以二者的積分吸光度比值作為該受體亞型的mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果肝臟組織中1a、1b AR亞型的相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組(0.86

2、7;0.38、0.23±0.10)均顯著高于肝硬化組(0.26±0.12、0.03±0.01，P0.01)。對(duì)照組及肝硬化組肝組織中1a亞型的表達(dá)量均顯著高于1b亞型(P0.01)。兩組肝組織中均無(wú)1d亞型的表達(dá)。結(jié)論肝硬化肝組織中1a和1b AR亞型基因表達(dá)減少是造成肝硬化時(shí)肝臟1 AR蛋白減少的重要原因，對(duì)門靜脈高壓癥的形成和維持可能起重要作用?！娟P(guān)鍵詞】肝硬化；受體，1腎上腺素；基因表達(dá)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) Expression of 1 adrenoceptor subtypes mRNA in liver tissues of cirrhotic pat

3、ients with portal hypertensionCHEN Lei, ZHU Jiye, LENG Xisheng, et al.The First Surgery Department, The People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044, China【Abstract】 Objective To investigate the expression of mRNA of 1 adrenoceptor (1AR) in liver tissues of cirrhotic patients wi

4、th portal hypertension. Methods Semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction (sqRT-PCR) was used to detect the expression of mRNA of 1 AR subtypes in liver tissues in 12 hepatitis B virus-related cirrhotic patients and 15 controls. In these patients routine liver biopsies we

5、re performed. Special 1 AR subtype product and internal standard GAPDH product were both amplified by RT-PCR. The ratio of their integral optical density (IA) was calculated as the relative expression of the 1 AR subtypes.Results The relative mRNA expression of 1a and 1b AR subtype in liver tissues

6、of cirrhotic patients (0.26±0.12,0.03±0.01) was significantly lower than that of controls (0.86±0.38, 0.23±0.10, P0.01). Neither cirrhotic patients nor controls showed 1d AR subtype in liver tissues. The relative mRNA expression of 1a AR subtype was significantly higher than that

7、 of 1b AR subtype in liver tissues of both cirrhotic patients and controls (P0.01). Conclusion The decreased expression of mRNA of 1a and 1b AR may underlie the decrease of 1 adrenoceptor proteins often seen in the liver tissues of cirrhotic patients, and may play an important role in the pathogenes

8、is and maintenance of portal hypertension.【Key words】 Liver cirrhosis; Receptor,1 adrenergic; Gene expressions; Reverse transcription polymerase chain reaction     肝硬化門靜脈高壓癥患者血中腎上腺素、去甲腎上腺素濃度升高1，肝組織中的1腎上腺素受體(1 AR)蛋白數(shù)量減少2，應(yīng)用 AR拮抗劑酚妥拉明后患者的門靜脈壓力降低3。但是，肝硬化時(shí)肝組織1 AR蛋白減少發(fā)生于轉(zhuǎn)錄還是翻譯水平，1 AR亞

9、型的變化如何及其意義目前還不清楚。為此，我們采用半定量-逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(sqRT-PCR)方法，檢測(cè)肝硬化門靜脈高壓癥患者肝臟組織中1 AR亞型mRNA的表達(dá)。 材料與方法1.標(biāo)本來(lái)源：肝硬化組12例，肝組織取自乙型肝炎后肝硬化門靜脈高壓癥患者。其中男6例，女6例，中位年齡45.6歲，均有乙肝史。對(duì)照組為正常肝組織15例，取自無(wú)高血壓、無(wú)肝臟疾患的膽囊疾病或胃腸道腫瘤患者，其中男11例，女4例，中位年齡46.7歲。所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。2.逆轉(zhuǎn)錄：反應(yīng)體系20l中含異硫氰酸胍一步法提取的肝組織總RNA 0.5g。隨機(jī)引物法逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈。每個(gè)樣本都設(shè)置不加逆轉(zhuǎn)錄酶的陰性對(duì)照。3.PC

10、R：(1)引物的設(shè)計(jì)與合成：采用計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)3種人1 AR亞型特異性引物。1a上游：5-CAGTCTTCCAAACATGCCCT-3；下游：5-CAGG-AGGATTGGTCTTTGGA-3；(1a cDNA的10481256堿基)擴(kuò)增片段209bp。1b上游：5-TAGAGGTGCTCGGCTACTGG-3；下游：5-ATGGAGATGACGGTGGACA-3；(1b cDNA的314534堿基)擴(kuò)增片段221bp。1d上游：5-CAAAGTCTCCAGCCTGTCG-3；下游：5-TATCGGTCTCCCGTAGGT-TG-3；(1d cDNA的15361714堿基)擴(kuò)增片段179bp。

11、內(nèi)參GAPDH上游：5-CGGAGTCAACGGATTTGGTGGTAT-3；下游：5-AGGCTTCTCCATGGTGGTAGAGAC-3；擴(kuò)增片段306bp。所有引物經(jīng)Genebank檢索具有特異性。(2)反應(yīng)體系及條件：25l體系中含cDNA 2l，25mol/L MgCl2 2l, 5mol/L 4×dNTPs 1l, 1 AR亞型及內(nèi)參引物各20pmol, 耐高溫DNA聚合酶(Taq酶)2U。條件：94預(yù)變性300s，94變性40s，58(1a)或57退火(1b及1d)45s，72延伸30s，72后延伸300s，循環(huán)30次。每一樣本均設(shè)置假逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蒸餾水為模板的陰性對(duì)照

12、。反應(yīng)結(jié)束后作瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察結(jié)果并照像。4.結(jié)果分析及統(tǒng)計(jì)：激光掃描像分析儀測(cè)定每一樣本目的片段和內(nèi)參片段的積分吸光度(IA)值，以二者比值做為該樣本的mRNA相對(duì)表達(dá)量。將對(duì)照組與肝硬化組的平均IA值作方差分析。結(jié)果對(duì)照組及肝硬化組肝組織中1a、1b AR的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果見(jiàn)1，各目的片段和內(nèi)參片段的IA比值見(jiàn)表1。兩組cDNA均不能擴(kuò)增出1d片段。而在同樣條件下，該cDNA可以擴(kuò)增出內(nèi)參片段；基因組DNA可以擴(kuò)增出預(yù)期的1d AR片段(2)。所有陰性對(duì)照均未擴(kuò)增出特異性片段。表12組病人肝組織1a和1b AR的目的片段與內(nèi)參片段擴(kuò)增帶IA的比值(<"0 (

13、55 bytes)" src="/med/cano/201003/20100322170058689" 8 9>±s)組別例數(shù)1 AR目的片段與內(nèi)參片段擴(kuò)增帶IA的比值1a AR1b AR對(duì)照組150.86±0.38(77%)0.26±0.12(23%)#肝硬化組120.23±0.10(88%)*0.03±0.01(12%)*#     注：與對(duì)照組比較，*P0.01；與1a AR比較，#P0.01括號(hào)內(nèi)為1AR亞型所占的百分?jǐn)?shù)   

14、60;注：M：PGEM-7Zf(+)/Hae Markers1、2：陰性對(duì)照(1為無(wú)模板組；2為RNA作模板組)；3、5：肝硬化組；2、4：對(duì)照組。11a、1bAR mRNA在對(duì)照組和肝硬化組患者肝組織中的表達(dá)    注：M為PGEM-7Zf(+)/HaeMarkers1:RT產(chǎn)物擴(kuò)出目的片段；2：同一RT產(chǎn)物不能擴(kuò)增出目的片段；3：基因組DNA為模板擴(kuò)出目的片段21dAR mRNA在肝組織的表達(dá)     討論 我們使用半定量RT-PCR方法檢測(cè)1 AR亞型在肝硬化門靜脈高壓癥患者肝臟組織中的表達(dá)。以前的研究發(fā)現(xiàn)總

15、RNA在400800ng之間，循環(huán)次數(shù)在40次以下，RNA的擴(kuò)增量隨模板量和循環(huán)次數(shù)成線性增長(zhǎng)4。我們?cè)谕惑w系中逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增一穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因GAPDH并以兩者比值作為mRNA相對(duì)表達(dá)量，能真實(shí)反映基因mRNA的實(shí)際表達(dá)量。不加逆轉(zhuǎn)錄酶的假逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和不加模板的PCR體系均不能擴(kuò)增出目的片段，說(shuō)明PCR產(chǎn)物來(lái)源于逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA而非基因組DNA。用cDNA擴(kuò)增不出1d目的片段，而在同樣條件下卻可以擴(kuò)增出內(nèi)參片段，且用基因組DNA為模板時(shí)可以擴(kuò)增出1d片段，說(shuō)明cDNA中不含基因組DNA，還說(shuō)明沒(méi)有1d的cDNA，即肝臟組織中沒(méi)有1d基因的mRNA表達(dá)。人們已用RNase保護(hù)分析法及競(jìng)爭(zhēng)性

16、RT-PCR方法檢測(cè)了1 AR亞型mRNA在正常人肝組織中的表達(dá)情況5-8。發(fā)現(xiàn)以1a為主(占75%98%)，1b次之(占4%25%)，未檢測(cè)到1dAR的mRNA表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，正常肝組織中1a占77%，1b占23%，與其他方法檢測(cè)的結(jié)果一致。1a、1b亞型的藥理學(xué)特性不同，在組織中的表達(dá)量又不相等，提示它們?cè)诟闻K中可能起不同的生理作用。肝硬化時(shí)以1a AR的表達(dá)為主，提示藥物治療門靜脈高壓癥時(shí)可用選擇性1a AR亞型拮抗劑。以往的研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化門靜脈高壓癥患者肝臟組織的1 AR蛋白數(shù)量減少2。本研究結(jié)果顯示，肝硬化時(shí)肝組織1a和1b亞型的mRNA顯著下降，說(shuō)明肝硬化時(shí)1a和1b AR

17、基因轉(zhuǎn)錄的減少是1 AR蛋白減少的重要原因。受體蛋白的減少可能會(huì)對(duì)腎上腺素、去甲腎上腺素的代謝及效應(yīng)產(chǎn)生影響，有助于造成肝硬化門脈高壓癥時(shí)二者水平明顯升高，門靜脈高壓癥得以形成和維持。基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(39500141)；衛(wèi)生部科研基金資助項(xiàng)目作者單位：100044北京醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院外一科參考文獻(xiàn)1，朱繼業(yè)，杜如昱，冷希圣，等.肝硬門靜脈高壓癥患者血腎上腺素、去甲腎上腺素濃度測(cè)定.中華外科雜志，1996，34：144-146.2，馮洪強(qiáng)，冷希圣，張忠明，等.肝硬門靜脈高壓癥病人肝組織中腎上腺素受體的變化.中華醫(yī)學(xué)雜志，1997，77：175-177.3，朱繼業(yè)，冷希圣，殷軍

18、，等.酚妥拉明對(duì)肝硬門靜脈高壓癥患者門靜脈壓力的影響.中華外科雜志，1997，35：924.4，馮洪強(qiáng)，冷希圣，張忠明，等.肝硬門靜脈高壓癥大鼠肝組織內(nèi)內(nèi)皮素-1基因mRNA的表達(dá).中華普通外科雜志，1998，13：114-116.5，Price DT, Lefkowitz RT, Caron MG, et al. Localization of mRNA for three distinct 1-adrenergic receptor subtypes in human tissues: implication for human -adrenergic physiology. Mol Pharmacol, 1993,45:171-1