CMV感染病兒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)及意義

1、CMV感染病兒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)及意義    巨細(xì)胞病毒(CMV)是已知病原微生物中最易引起小兒急、慢性感染的病毒之一，早期準(zhǔn)確診斷CMV感染具有重要的意義1。CMV感染的臨床表現(xiàn)多樣, 以往多通過(guò)檢測(cè)血清特異性IgM以及定性PCR檢測(cè)病毒DNA進(jìn)行診斷，但易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果。     作者：劉薇，蔣玉紅，孫佰秀，李海峰，羅兵    作者單位：青島市婦女兒童醫(yī)療保健中心檢驗(yàn)科，山東 青島 266011； 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室）   【摘要】

2、60; 目的 探討實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)病兒尿液中巨細(xì)胞病毒(CMV）DNA含量在診斷和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CMV感染中的意義。方法 應(yīng)用PE 5700全自動(dòng)PCR擴(kuò)增分析儀，檢測(cè)35例臨床高度懷疑有CMV感染病兒（病兒組）尿液中的CMVDNA拷貝數(shù),隨機(jī)選擇45例同年齡段患非感染性疾病病兒作為對(duì)照組,比較兩組CMV陽(yáng)性標(biāo)本中CMVDNA含量，并測(cè)定治療后的病毒載量。同時(shí)與血清CMVIgM抗體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。對(duì)部分病兒進(jìn)行臨床觀察和隨訪。結(jié)果 病兒組CMV感染27例,陽(yáng)性檢出率為77.14%;對(duì)照組CMV感染12例,陽(yáng)性檢出率為26.67%。治療后兩組病兒尿液中CMVDNA拷貝數(shù)下降幅度均較大,與治療

3、前比較, 差異有顯著性（t=4.159、5.438，P<0.01）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法CMV陽(yáng)性檢出率高于血清CMVIgM檢測(cè)方法。9 例病兒隨訪2年,1例膽管閉鎖病兒手術(shù)后CMV病毒載量仍在較高水平,1年后發(fā)展為肝硬化；4例CMV 肝炎經(jīng)治療后, 1 例CMVDNA轉(zhuǎn)陰，3例仍陽(yáng)性；4例無(wú)癥狀性感染病兒CMVDNA轉(zhuǎn)陰或降至低水平。結(jié)論 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)CMV感染具有快捷、靈敏度高、特異度高等優(yōu)點(diǎn)，量化結(jié)果便于對(duì)治療過(guò)程進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，為病兒治療和隨訪提供有效幫助。 【關(guān)鍵詞】  巨細(xì)胞病毒感染；熒光免疫測(cè)定；聚合酶鏈反應(yīng) 巨細(xì)胞病毒(CMV)是已知病原微生物中最易

4、引起小兒急、慢性感染的病毒之一，早期準(zhǔn)確診斷CMV感染具有重要的意義1。CMV感染的臨床表現(xiàn)多樣, 以往多通過(guò)檢測(cè)血清特異性IgM以及定性PCR檢測(cè)病毒DNA進(jìn)行診斷，但易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果。本文采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)可疑CMV感染病兒尿標(biāo)本中CMVDNADNAIgM抗體檢測(cè)  采集小兒非抗凝靜脈血2 mL，分離血清置4 保存，采用美國(guó)HOPE公司生產(chǎn)ELISA試劑盒檢測(cè)血清CMVIgM抗體。 1.3  治療方法     癥狀性感染組病兒一經(jīng)確診有CMV感染，立即給予更昔洛韋10 mg（kg·d）加入50 g/L葡萄糖注射液

5、100200 mL中靜脈滴注，連用10 d為1個(gè)療程，同時(shí)輔以保肝藥物如維生素C、肝復(fù)肽等治療。根據(jù)病情和肝功能、CMV病毒載量的復(fù)查結(jié)果決定治療療程。無(wú)癥狀性感染組病兒用更昔洛韋抗病毒治療1個(gè)療程。 1.4  隨訪     癥狀性感染組和無(wú)癥狀性感染組病兒分別于治療后半年、1年和2年監(jiān)測(cè)肝功能和CMV病毒載量，并應(yīng)用無(wú)創(chuàng)性超聲觀察小兒的肝臟形態(tài)學(xué)、血流動(dòng)力學(xué)相關(guān)指標(biāo)改變及肝臟是否有纖維化。 1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法     用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，CMVDNA拷貝數(shù)以指數(shù)表示（log10）x。計(jì)量資

6、料組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較用2檢驗(yàn)。 2  結(jié)果 2.1  實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)     病兒組CMV陽(yáng)性者（癥狀性感染）27例,占77.14%；對(duì)照組CMV陽(yáng)性者（無(wú)癥狀性感染）12例,占26.67%。與治療前比較，兩組治療后CMVDNA拷貝數(shù)指數(shù)下降幅度均較大,差異有顯著性（t=4.159、5.438，P<0.01）。治療前、治療后兩組間CMVDNA拷貝數(shù)指數(shù)比較，差異均有顯著性（t=2.454、2.432，P<0.05）。見(jiàn)表1。 2.2  兩種方法的檢測(cè)結(jié)果比較     實(shí)

7、時(shí)熒光定量PCR法CMV陽(yáng)性檢出率為48.75%(39/80), 血清CMVIgM檢測(cè)方法CMV陽(yáng)性檢出率為13.75%(11/80)，前者陽(yáng)性檢出率高于后者。 2.3  隨訪結(jié)果     9例病兒隨訪2年,1例膽管閉鎖病兒手術(shù)后CMV病毒載量仍在較高水平,1年后發(fā)展為肝硬化；4例CMV肝炎病兒治療后, 1例CMVDNA轉(zhuǎn)陰，3例CMVDNA仍陽(yáng)性，其中1例預(yù)后不良，3例預(yù)后良好；4例無(wú)癥狀性感染病兒CMVDNA轉(zhuǎn)陰或降至低拷貝水平。 表1  癥狀性感染組與無(wú)癥狀性感染組治療前后CMVDNA拷貝數(shù)指數(shù)比較（略） 與治療前比較，t=4.159、5

8、.438，P<0.01；與無(wú)癥狀性感染組比較，#t=2.454、2.432，P<0.05 3  討論     CMV屬皰疹病毒類,具有潛伏活動(dòng)的生物學(xué)特征。CMV感染的流行病學(xué)研究表明,約有3%的新生兒在出生時(shí)就已感染CMV,表明該病毒可經(jīng)胎盤(pán)感染胎兒3，造成胎兒嚴(yán)重疾病的感染通常發(fā)生在妊娠的最初12周內(nèi)4。CMV感染在我國(guó)流行廣泛,胎兒及免疫力低下的小病兒易受侵害,臨床表現(xiàn)與年齡有關(guān),年齡大者感染CMV后臨床癥狀輕,可表現(xiàn)為無(wú)癥狀性感染；胎兒期和圍生期發(fā)生的CMV感染臨床癥狀較重, 表現(xiàn)復(fù)雜，可造成先天性腦白質(zhì)發(fā)育不良,某些病例預(yù)后差,有致

9、殘、致死的可能5。本文中5例臨床表現(xiàn)嚴(yán)重的病兒均在出生后2月內(nèi)發(fā)病,3例為早產(chǎn)兒, 1例膽管閉鎖病兒最終發(fā)展為肝硬化。因此，及早診斷CMV感染并系統(tǒng)性治療能減少并發(fā)癥的發(fā)生，病兒預(yù)后良好。     本文對(duì)CMV感染病兒隨訪2年，有9例資料完整，其中1例膽管閉鎖病兒于出生后2周發(fā)病，總膽紅素和直接膽紅素明顯升高，10周時(shí)手術(shù)治療后肝功能明顯好轉(zhuǎn)，CMV載量一直維持較高拷貝數(shù)，治療后1年隨訪時(shí)已發(fā)展為肝硬化，預(yù)后不良。4例無(wú)癥狀的CMV 感染病兒,在治療后2例CMVDNA轉(zhuǎn)陰，2例降至低水平的陽(yáng)性，隨訪2年預(yù)后較好，肝功能正常，超聲檢查肝臟正常。4例CMV肝炎病兒中1

10、例治療后CMVDNA轉(zhuǎn)陰，3例治療后病毒載量下降，其中1例于出生后2周發(fā)病病兒治療后病毒載量下降不明顯，隨訪2年中一直在較高水平，肝功能在治療后半年時(shí)又出現(xiàn)異常，谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高1倍，抗病毒和保肝治療后肝功能正常，超聲檢測(cè)提示肝臟輕度纖維化。肝纖維化是肝硬化的早期階段，是可逆性的，一旦發(fā)展至肝硬化則難以恢復(fù)6。所以，對(duì)CMV感染病兒要在治療后幾年中監(jiān)測(cè)CMV病毒載量和肝功能水平，發(fā)現(xiàn)異常后及時(shí)治療，防止肝臟纖維化的發(fā)生。先天性膽管閉鎖過(guò)去認(rèn)為是一種先天畸形，由發(fā)育障礙引起，近年來(lái)提出炎癥學(xué)說(shuō)。本文有1例肝外膽管閉鎖病兒經(jīng)血清學(xué)及尿標(biāo)本CMVDNA檢測(cè)均證明有CMV感染，臨床上表現(xiàn)為黃疸顏色深,大

11、便白色,肝臟進(jìn)行性增大、質(zhì)硬，手術(shù)后1年出現(xiàn)肝硬化,預(yù)后不良，從病毒學(xué)角度證明CMV肝炎可能發(fā)展為膽管閉鎖。該病兒可能在出生前由母親胎盤(pán)感染CMV，引起膽管炎癥，進(jìn)而出現(xiàn)膽管閉鎖。     以往國(guó)內(nèi)對(duì)CMV感染的診斷主要依賴血清特異性IgM的檢測(cè), 但由于IgM受人體生理及病理狀況影響, 易出現(xiàn)假陰性，而且本文研究對(duì)象均為1歲以內(nèi)的病兒，其細(xì)胞和體液免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟，感染病毒后不能有效產(chǎn)生免疫應(yīng)答7，可出現(xiàn)假陰性,所以用血清CMVIgM檢測(cè)方法確診CMV感染具有局限性。本文實(shí)時(shí)熒光定量PCR法CMV感染陽(yáng)性檢出率為48.75%(39/80),而血清CMVIgM檢

12、測(cè)方法CMV感染的陽(yáng)性檢出率為13.75%(11/80)，說(shuō)明實(shí)時(shí)熒光定量PCR法可以提高小兒CMV感染的檢出率。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法采用熒光探針定量基因檢測(cè)技術(shù)，是在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型定量檢測(cè)法8。與定性PCR方法相比, 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法采用完全閉管檢測(cè), 無(wú)PCR后處理, 避免了交叉污染,通過(guò)探針雜交進(jìn)一步提高了特異性9；檢測(cè)信號(hào)實(shí)時(shí)檢測(cè)產(chǎn)物量,定量結(jié)果準(zhǔn)確，而且重復(fù)性好，可用于體內(nèi)CMV的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定尿CMVDNA含量可用于臨床早期快速診斷小兒CMV感染,對(duì)于指導(dǎo)臨床治療、評(píng)價(jià)抗病毒治療的效果具有重要臨床意義。   

13、60; 由于本研究隨訪到的資料完整的病例數(shù)較少,不足以說(shuō)明病兒CMV感染的預(yù)后情況，有待繼續(xù)積累資料，進(jìn)一步探討實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在監(jiān)測(cè)病兒CMV感染轉(zhuǎn)歸中的價(jià)值。 【參考文獻(xiàn)】   1尚世強(qiáng),陶然. 兒童巨細(xì)胞病毒感染的診斷J. 實(shí)用兒科臨床雜志, 2006,21(22):15981600.    2方峰,董永綏. 巨細(xì)胞病毒和巨細(xì)胞病毒感染的診斷J. 中華兒科雜志, 1999,37:397399.    3黃素芳,于立君. 熒光PCR基因檢測(cè)技術(shù)診斷小兒活動(dòng)性巨細(xì)胞病毒感染的研究J. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)

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