利用稻草液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶優(yōu)化培養(yǎng)基

1、利用稻草液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶優(yōu)化培養(yǎng)基2010年3月第33卷第1期湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)JournalofNaturalScienceofHunanNormalUniversityV01.33N0.1Mar.,2010利用稻草液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶優(yōu)化培養(yǎng)基譚宏,劉選明,廖紅東,謝莫湘濤2,鄧樂,王驪,梁志坤,廖勝輝,紀(jì)鴻雁鑫,朱立超,張?jiān)?1.湖南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)研究院,中國(guó)長(zhǎng)沙410082;2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國(guó)長(zhǎng)沙410081)摘要選用液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)良菌株里氏木霉HC-415,在搖瓶階段,通過正交試驗(yàn)等對(duì)稻草培養(yǎng)基中稻草粉與豆粕粉的用量等因素進(jìn)行了研究,確定了優(yōu)化的培

2、養(yǎng)基配方和產(chǎn)酶條件.當(dāng)一級(jí)種接種體積分?jǐn)?shù)為15%,一級(jí)種培養(yǎng)時(shí)問24h;產(chǎn)酶培養(yǎng)基稻草粉與豆粕粉質(zhì)量比為6:1,P(KHPO)=0.01g/mL,P(CaCI2)=0.006g/mL,聚醚不加,裝瓶量為50mL/250mL瓶,培養(yǎng)120h時(shí),發(fā)酵液纖維素酶活性最高.此時(shí),CMCase酶活性平均為94.62U/mL;FPA酶活性平均為l6.04U/mL.關(guān)鍵詞稻草;液體發(fā)酵;里氏木霉;纖維素酶;正交試驗(yàn)中圖分類號(hào)Q93.335文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1000-2537(2010)O1-0114-06ProductionofCellulaseUsingtheStrawSubmergedFermenta

3、tionTANHong,LIUXuan.ming,LIAOHongdong,XIELi,LIANGZhikun,LIAOShenghui,JlHong-yan,MOXiang.tao,DENGLe,WANGXin,ZHULi.chao,ZHANGYuan-r02(1.LifeSciencesandTechnicalInstitute,HunanUniversity,Changsha410082,China;2.LifeSciencesCollege,HunanNormalUniversity,Changsha410081,China)AbstractrI1IIefinestrain(Trich

4、odermareeseiHC-415)isstudiedinthecellulaseproductionbysubmergedfermentation.Thefactorsinstrawmediumarealsostudiedaccordingtoorthogonalexperimentsonshakingbottlestage.rI1leoptimizedmedium&conditionsofproducingenzymeareconfirmed.Thecellulaseactivityinfermentablesolutionisthehighestwhenthestair

5、inoculationdosageis15%,theculturedtimeofstairstrainis24h,thepropor-tionbetweenstrawandbeancakepowderinmediumproducingcelullaseis6:1,theconcentrationofKH2PO4andCaC12inmediumrespectivelyis0.01g/mLand0.006g/mLete.Atthistime,theaverageCMCandFPenzymeactivitiesale94.62U/mLand16.04U/mL.Keywordsstraw;submer

6、gedfermentation;trichodermareesei;eellulase;orthogonalexperiments纖維素酶(Cellulase)是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱¨.纖維素酶在食品,飼料,紡織,農(nóng)產(chǎn)品加工,石油開采和資源再生等方面具有廣泛的用途和應(yīng)用前景;特別是在利用廢棄秸稈生產(chǎn)酒精的生物能源開發(fā)方面,具有巨大的潛在價(jià)值.湖南省農(nóng)業(yè)資源優(yōu)勢(shì)明顯,每年僅稻草的產(chǎn)量就有數(shù)千萬噸;合理利用與轉(zhuǎn)化這些纖維素資源對(duì)于解決工農(nóng)業(yè)原料來源,能源危機(jī),環(huán)境污染等具有重要的意義.本文選用液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)良菌株里氏木霉HC-415_3J,在搖瓶階段,通過正交試驗(yàn)等

7、對(duì)稻草培養(yǎng)基中稻草粉與豆粕粉的用量,一級(jí)種接種量,一級(jí)種培養(yǎng)時(shí)間,二級(jí)產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間,通氣量,無機(jī)鹽等因素進(jìn)行了研究,確定了優(yōu)化收稿日期:2009.12-03基金項(xiàng)目:湖南省科技廳基金資助項(xiàng)目(2007NK3099)通訊作者.E?mail:hnuth126.tom第1期譚宏等:利用稻草液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶優(yōu)化培養(yǎng)基115的培養(yǎng)基配方和產(chǎn)酶條件.為利用稻草液體深層發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的研究提供了基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)依據(jù).現(xiàn)將結(jié)果報(bào)導(dǎo)如下.1材料和方法1.1菌種里氏木霉(Trichodermareesei)HC-415.1.2培養(yǎng)基1.2.1斜面培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基.1.2.2一級(jí)種搖瓶培養(yǎng)基麩皮0.02g/mL,葡萄

8、糖0.03g/mL,(NH4)2SO0.0015g/mL,pH5.56.0.1.2.3二級(jí)產(chǎn)酶搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基稻草粉,豆粕粉,無機(jī)鹽等,pH5.56.0.1.3主要儀器設(shè)備722S分光光度計(jì);電熱恒溫水浴鍋;Universal32R臺(tái)式冷凍離心機(jī);HZQQ全溫?fù)u瓶柜.1.4酶活性測(cè)定方法1.4.1羧甲基纖維素酶活性(CMCase)測(cè)定DNS法,0.5mL適當(dāng)稀釋的酶液加入0.005g/mLCMCNa溶液1.5mL.50酶解30min,加3mLDNS試劑.沸水浴10min顯色,測(cè)還原糖.1.4.2濾紙?zhí)敲富钚?FPA)測(cè)定參照Mandels,蔣傳葵DNS法引.1mL適當(dāng)稀釋的待測(cè)酶液,加入1mL0

9、.05mol/L(pH4.6)檸檬酸鹽緩沖液和1條1omx6cm新華1號(hào)濾紙.5O酶解1h,加DNS試劑3mL,沸水浴10min.顯色測(cè)還原糖,扣除空白后計(jì)算酶涪陛.酶液活性單位規(guī)定:1h水解生成1mg葡萄糖的酶量為1個(gè)活性單位(u).2結(jié)果與討論2.1二級(jí)產(chǎn)酶培養(yǎng)基稻草粉與豆粕粉的用量對(duì)纖維素酶活性的影響參照文獻(xiàn)3,此試驗(yàn)中一級(jí)種制備為:250mL三角瓶中,一級(jí)種培養(yǎng)基裝量100mL,2830全溫?fù)u瓶柜中150r/min培養(yǎng)40h.二級(jí)產(chǎn)酶培養(yǎng)基為:250mL三角瓶中,培養(yǎng)基裝量100mL;無機(jī)鹽KH2PO0.005g/mL,CaC10.003g/mL,不加聚醚;一級(jí)種接種體積分?jǐn)?shù)為10%,

10、(304-1)全溫?fù)u瓶柜中140170r/min培養(yǎng)144h.產(chǎn)酶培養(yǎng)基稻草粉與豆粕粉的用量對(duì)纖維素酶活性的影響見表1.表1二級(jí)產(chǎn)酶培養(yǎng)基稻草粉與豆粕粉用量對(duì)纖維素酶活性的影響從表1可知,稻草粉與豆粕粉的質(zhì)量比為4:1時(shí),CMCase酶活性較高,平均為85.88U/mL;6:1時(shí),FPA酶活性較高,平均為9.8U/mL.盡管本實(shí)驗(yàn)中,用豆粕粉代替了以前使用的豆餅粉,但稻草粉與豆粕粉的質(zhì)量比仍與以前一樣.表明作為氮源的豆餅粉與豆粕粉可以互換使用.在后面的試驗(yàn)中,作者選定的產(chǎn)酶培養(yǎng)基稻草粉與豆粕粉質(zhì)量比為6:1.2.2一級(jí)種接種量等對(duì)纖維素酶活性影響的正交試驗(yàn)采用IJ9(3)正交表,對(duì)一級(jí)種接種量

11、,培養(yǎng)時(shí)間,二級(jí)產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間和通氣量4因素作搖瓶正交試驗(yàn).二級(jí)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中KH2PO0.005g/mL,CaCI20.003g/mL;聚醚不加.2.2.1實(shí)驗(yàn)因素水平安排見表2,正交試驗(yàn)共進(jìn)行了兩批次.116湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)第33卷A一級(jí)種接種體積分?jǐn)?shù)/%B二級(jí)產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間/hc一級(jí)種培養(yǎng)時(shí)間/hD通氣量(250mL瓶裝量/mL)51202450l514448loo2516872l502.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析對(duì)正交試驗(yàn)各搖瓶編號(hào)的提取酶液,分別測(cè)定CMCase及FPA酶活性.分析時(shí)同時(shí)采用極差分l析與方差分析的方法.所得結(jié)果見表3和表4.表3一級(jí)種接種量等因子搖瓶正交試驗(yàn)CMC酶活性結(jié)

12、果分析從表3看,一級(jí)種接種量等因子對(duì)CMCrise的影響,通過極差分析其順序?yàn)镈>B>A>C,最佳配方為DtB.A:C,;方差分析的顯著性順序與極差分析一致.從表4看,一級(jí)種接種量等因子對(duì)FPA酶活性的影響,極差分析與方差分析的順序均為D>B>C>A,最佳配方則為DBCA.表明在稻草培養(yǎng)基中,通氣量與產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶的生成具有重要作用,尤其是通氣量的作用最為顯著,通氣量D.表明HC-415菌液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶時(shí),耗氧量較高,這是與以前報(bào)道不一致的地方引.產(chǎn)纖維素酶最佳組合:一級(jí)種接種體積分?jǐn)?shù)為15%,二級(jí)

13、產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間168h,一級(jí)種培養(yǎng)時(shí)間24h,通氣裝瓶量50mL.對(duì)比9號(hào)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),兩者結(jié)果基本吻合;CMCase酶活性最高平均為85.56U/mL;FPA酶活性最高平均為11.78U/mL.第1期譚宏等:利用稻草液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶優(yōu)化培養(yǎng)基表4一級(jí)種接種量等因子搖瓶正交試驗(yàn)FPA酶活性結(jié)果分析1l72.3無機(jī)鹽等因素對(duì)纖維素酶活性影響的正交試驗(yàn)以上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),采用(3)正交表,進(jìn)一步研究了二級(jí)產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間,培養(yǎng)基中KH:POCaC1,聚醚對(duì)纖維素酶活性的影響.此正交試驗(yàn)中一級(jí)種接種體積分?jǐn)?shù)為15%,一級(jí)種培養(yǎng)時(shí)間24h,二級(jí)產(chǎn)酶培養(yǎng)基裝瓶量為在250mL三角瓶中裝入50mL.2.3.1實(shí)

14、驗(yàn)因素水平安排見表5.正交試驗(yàn)共進(jìn)行了兩批次.表5無機(jī)鹽等正交試驗(yàn)因子及水平安排表2.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析對(duì)本正交試驗(yàn)各搖瓶編號(hào)的提取酶液,分別測(cè)定CMCase及FPA酶活性.分析時(shí)采用極差分析與方差分析的方法.所得結(jié)果見表6和表7.118湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)第33卷表7無機(jī)鹽等因子搖瓶正交試驗(yàn)FPA酶活性結(jié)果分析第1期譚宏等:利用稻草液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶優(yōu)化培養(yǎng)基ll9從表6看,無機(jī)鹽等因子對(duì)CMCase的影響,通過極差分析其影響順序?yàn)镃>B>A>D,最佳配方為CBAD;方差分析的顯著性順序與極差分析一致.從表7看,無機(jī)鹽等因子對(duì)FPA酶活性的影響

15、,極差分析與方差分析的影響順序則為B>C>A>D,最佳配方為BC,AD.表明稻草培養(yǎng)基中,KHPO與CaC1:對(duì)纖維素酶的生成具有重要作用,而產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)問則排到了第三位,聚醚的影響不顯著.CaC1:對(duì)CMCase的生成最重要;而KHPO對(duì)FPA酶的生成最重要.產(chǎn)纖維素酶最佳組合為:KH2PO0.01g/mL,CaC1:0.006g/mL,二級(jí)產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間120h,聚醚不加.對(duì)比3號(hào)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),兩者結(jié)果基本吻合;CMCase酶活性最高平均為94.62U/mL;FPA酶活性最高平均為16.04U/mL.有文獻(xiàn)報(bào)道L6J,聚醚作為表面活性劑,一是可以消泡,二是

16、能促進(jìn)酶分子從菌體表面加速擴(kuò)散到發(fā)酵液里,使酶合成的動(dòng)態(tài)平衡向產(chǎn)酶方向移動(dòng),從而增加酶的活性.但本試驗(yàn)中聚醚的影響屬于不顯著,這是與報(bào)道不一致的地方.從表6,表7看,D列的Kl,l<2及K3值的分布不太合規(guī)律.因此,作者認(rèn)為聚醚對(duì)HC-415菌的產(chǎn)酶作用不會(huì)太簡(jiǎn)單,值得今后進(jìn)一步研究.另外經(jīng)此優(yōu)化后,二級(jí)產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間由2.2中最佳的168h縮短至120h,無疑有利于今后工業(yè)化的生產(chǎn).3結(jié)論(1)采用搖瓶平行試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合研究培養(yǎng)基的優(yōu)化組成問題,對(duì)于以后利用里氏木霉HC-415菌在發(fā)酵罐中進(jìn)行稻草液體深層發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的工業(yè)化試驗(yàn)具有重要的指導(dǎo)意義.優(yōu)化后的培養(yǎng)基組合能明

17、顯提高纖維素酶的活性并縮短發(fā)酵時(shí)間.(2)底物濃度及C/N對(duì)纖維素酶的產(chǎn)生有較大的影響r.由2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可知里氏木霉HC-415菌對(duì)稻草培養(yǎng)基固形物的濃度要求為0.050.07g/mL.超過0.09g/mL時(shí),酶活性顯著降低.產(chǎn)酶培養(yǎng)基中稻草粉與豆粕粉最佳用量比例為4:16:1.(3)綜合2.2及2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可知里氏木霉HC-415菌利用稻草液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶時(shí),培養(yǎng)基的通氣量,無機(jī)鹽KHPO,CaC1和二級(jí)產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶的生成具有顯著性的影響.優(yōu)化后的稻草培養(yǎng)基最佳產(chǎn)酶時(shí)間能縮短2d.(4)表面活性劑聚醚在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)里氏木霉HC-415菌利用稻草液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響不顯著,其機(jī)理有待進(jìn)一步的深入研究.參考文獻(xiàn):1WOODTM,MCCRAES1.SinergismbetweenenzymesinvolvementinthesolubilizationofnativecelluloseJ.AdvChemSet,1979,18(1):181-209:2LEERL,PAULJ.Microbialeellulaseutilization:fundamentalsandbiotechnonlgyJ.MicrobiolMolBiolRev,2002,(9):506-577.3譚宏,謝小保,莫勇.里氏木霉液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的研究J.工業(yè)微生