成纖維細(xì)胞生長因子受體在腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的表達(dá)

1、    成纖維細(xì)胞生長因子受體在腎間質(zhì) 成纖維細(xì)胞的表達(dá)*        關(guān)鍵詞細(xì)胞生長因子成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖 在腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，損傷和再生的腎小管上皮細(xì)胞可以合成和分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）就是其中的一種。研究FGF的靶細(xì)胞或細(xì)胞受體（FGFR），對于揭示FGF在腎小管間質(zhì)纖維化中的作用有重要意義。1材料和方法11材料Wistar大鼠，雌性，體重200250g(北京醫(yī)科大學(xué)實驗動物提供)。并選用了1996年至1997

2、年北京醫(yī)科大學(xué)病理系腎穿刺標(biāo)本有增生硬化性改變的腎小球腎炎20例，均伴有腎小管間質(zhì)纖維化，5例輕度系膜增生性腎小球腎炎作為對照。12細(xì)胞培養(yǎng)Wistar大鼠1只，斷頭，無菌條件下取腎，在Hank液里剪碎，種入培養(yǎng)瓶，20小牛血清DMEM培養(yǎng)，1周后傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，鋪滿瓶底后收集，光鏡、電鏡觀察，Keratin免疫組化染色陰性，Vimentin陽性，進(jìn)一步經(jīng)過含右旋纈氨酸的DMEM培養(yǎng)基替代培養(yǎng)，鑒定為成纖維細(xì)胞。13RT-PCR異硫氰酸胍一步法1提取培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞總RNA；FGFR1引物2：上游5-CTAGACGTTGTGGAGCGAT-3下游5-AGGTCATCACGGCTGGTCT-3合

3、成片段大?。?76bp，由北京醫(yī)科大學(xué)病理系合成。擴增條件：25l體系，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1l，10×buffer 2.5l，引物各0.5 molL，dNTP 160 molL，Mg21.5 mmolL，Taq酶2U，94預(yù)變性1min后；94變性40s，60退火40s，72延伸30s，30循環(huán)；最后延伸7min。取PCR產(chǎn)物10l進(jìn)行1瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察。14免疫組化LSAB法，兔抗人FGFR1單克隆抗體（150稀釋，SantaCruz），不加1抗為陰性對照。153H-TdR摻入法觀察bFGF對腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的促增殖作用將第二代培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化，以104個孔種入96孔板，8

4、h后換成1小牛血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)20h，加入bFGF，使終濃度分別為5 gL、10 gL、50 gL，每個濃度設(shè)3個平行孔，并設(shè)3個對照孔，分別于8、24、32、48h收集細(xì)胞，收集細(xì)胞前7h加入0.5ci孔3H-TdR。將細(xì)胞收集到玻璃纖維濾紙上，烘干，浸入閃爍液（PPO：0.1，POPOP：0.05），Beckman液閃儀檢測。2結(jié)果21RT-PCR對培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR，可擴增出376bp特異條帶，說明腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞有FGFR1的mRNA表達(dá)。22免疫組化培養(yǎng)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞FGFR1陽性。伴有腎間質(zhì)纖維化的人腎組織FGFR1強陽性分布于損傷和再生的腎小管，腎間

5、質(zhì)成纖維細(xì)胞、單個核細(xì)胞亦強陽性；而對照組陰性。23bFGF對培養(yǎng)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞促增殖實驗加入濃度為5 gL、10 gL、50 gL的bFGF后，各時間點3H-TdR摻入率均高于對照組（附表）。附表不同濃度bFGF刺激腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞3時間（h）濃度 (gL)051050871833±7631125725±9324*109753±11207*96540±9411*1669891±7201104301±11089*99112±9630*96367±9835*2464001±714486933±

6、8479*85743±8814*68434±71644841182±393658701±6191*59134±5537*43534±4901     與未加bFGF組相比*P0.05，?*P0.01 3討論腎小管間質(zhì)纖維化可由進(jìn)行性腎小球損傷、慢性腎小管損傷和慢性間質(zhì)性腎炎引起，尤以各種進(jìn)行性腎小球損傷常見。在上述各種損傷中，損傷和再生的腎小管上皮細(xì)胞可以合成和分泌FGF3。FGF發(fā)揮作用，必須有其靶細(xì)胞，靶細(xì)胞則應(yīng)具有FGFR。FGFR有兩種，一種為高親合力受體，屬酪氨酸蛋白激酶類受體；另一種

7、為低親合力受體，屬肝素樣受體。高親合力受體由胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)組成，胞外區(qū)含23個免疫球蛋白結(jié)合位點類似區(qū)。目前已克隆出五個與高親合力受體有關(guān)的基因，不同基因在結(jié)構(gòu)和親合力方面有所不同，F(xiàn)GFR1、FGFR2和FGFR3可與aFGF和bFGF結(jié)合2，4。本研究表明，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞有FGFR1的mRNA表達(dá)，損傷和再生的腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞以及單個核細(xì)胞均有FGFR1的蛋白合成，從而說明損傷和再生的腎小管上皮細(xì)胞所產(chǎn)生的FGF通過自分泌和旁分泌的途徑，雖然有促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的再生和增生作用，也有促進(jìn)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生的作用，最終導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化的形成。*國家自然科學(xué)基金

8、資助課題（39770293）作者單位：北京醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系（北京，100083）參考文獻(xiàn)1 Chomczynski P，Sacchi NSingle-step method of RNA isolation by acid guanidine thiocyanate-phenol-chloroform extrationAnalytic Biochem，1987，162：1562 Miriam DFJennifer C，Ursula G et alExpression of fibroblast growth factors and their receptors in rat glomeruliKidney Int，1997，51：17293 杜愛萍，鄒萬忠等腎小管上皮細(xì)胞損傷與成纖維細(xì)胞生長因子的關(guān)系腎臟病與透析腎移植雜志，1997，6（3）：2214 Jaye M，Schkessinger J，Cra