成骨生長(zhǎng)肽調(diào)節(jié)鼠胚顱蓋骨成骨細(xì)胞樣細(xì)胞酶活性的觀察

1、    成骨生長(zhǎng)肽調(diào)節(jié)鼠胚顱蓋骨成骨細(xì)胞樣 細(xì)胞酶活性的觀察        摘要目的觀察成骨生長(zhǎng)肽(Osteogenic growth peptide,簡(jiǎn)稱OGP)對(duì)SD大鼠鼠胚顱蓋骨成骨細(xì)胞樣細(xì)胞酶活性的影響。方法無(wú)菌條件下培養(yǎng)鼠胚顱蓋骨成骨細(xì)胞樣細(xì)胞，分為不加OGP的對(duì)照組和加OGP的用藥組，用藥組在10-12M10-8M OGP濃度范圍內(nèi)，再分為三組(分別為OGP濃度10-12M、10-10M、10-8M)，收集以上四組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，測(cè)定它們的堿性磷酸酶及

2、酸性磷酸酶活性。結(jié)果 用藥組的堿性磷酸酶活性均顯著地高于對(duì)照組(P<0.010.05，用藥組OGP 10-8M濃度、培養(yǎng)7天的細(xì)胞培養(yǎng)液中堿性磷酸酶活性為0.82±0.16U/L，而對(duì)照組同樣條件活性為0.23±0.10U/L)，且隨著OGP濃度的升高堿性磷酸酶活性也升高，而酸性磷酸酶用藥組與對(duì)照組無(wú)顯著差異。結(jié)論OGP能促進(jìn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞分泌堿性磷酸酶。關(guān)鍵詞成骨生長(zhǎng)肽成骨細(xì)胞樣細(xì)胞堿性磷酸酶 Regulatory role of osteogenic growth peptide on enzyme activity of osteoblast-like cell

3、s in ratsLi Qun，Wang Zhixing，Zhu Yaping（Department of Orthopedics,Ruijin Hospital, Shanghai Medical University,and Shanghai Institute of Traumatology and Orthopedics,Shanghai 200025,China）AbstractObjective To investigate the regulatory role of osteogenic growth peptide (OGP)on enzyme activity of ost

4、eoblast-like cells in rats.Methods The isolated osteoblastic cells from calvaria of newborn ras were cultured in vitro.Cutured osteoblastic-like cells were divided into two groups:one group was added with OGP,the other was added with DMEM as the control group.The experimental group was further divid

5、ed into three subgroups(10-8M,10-10M and 10-12M OGP).The activities of alkaline phosphatase and acid phosphatase in these 4 groups were determined.Results The activities of alkaline phosphatase in cells and extracellular matrix of the experimental group were significantly higher than that of the con

6、trol group(P<0.01,0.82±0.16 U/L for OGP 10-8M group on 7 th culture day in extracellular matrix and 0.23±0.10 U/L for the control group).No change in activities of acid phosphatase in osteoblast-like cells and extracellular matrix between the control group and the experimented group was

7、 observed.The alkaline phosphatase activities of cells and extracellular matrix in the exprimental group were gradually upregulated with increasing concentrations of OGP from 10-12M to 10-8M in range. Conclusion OGP can enhance alkaline phosphatase activity in osteoblast-like cells,thereby promoting

8、 osteogenic effect.Key wordsAlkaline phosphatase Osteogenic-like cells Osteogenic growth peptide成骨生長(zhǎng)肽(Osteogenic growth peptide,簡(jiǎn)稱OGP)是新近發(fā)現(xiàn)的具有促進(jìn)成骨作用和刺激造血的多肽類因子，在骨形成和骨髓造血方面有獨(dú)特的作用，目前正日益成為研究的熱點(diǎn)。本文通過(guò)OGP對(duì)SD大鼠鼠胚顱蓋骨成骨細(xì)胞樣細(xì)胞酶活性影響的觀察，證實(shí)OGP能促進(jìn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞分泌堿性磷酸酶，而且不同濃度的OGP對(duì)細(xì)胞的促分泌作用也有差異，為OGP在治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松方面提供了理論依據(jù)。1材料和方

9、法1.1動(dòng)物出生24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠，本研究所動(dòng)物房提供。1.2試劑及儀器對(duì)硝基苯酯二鈉鹽(上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司)；成骨生長(zhǎng)肽(SIGMA公司)；胎牛血清(中科院上海生物制品研究所)；7530紫外可見分光光度計(jì)(上海分析儀器三廠)；Hitachi 52D高速離心機(jī)(日本日立公司)；Olympus AHBT研究顯微鏡(日本Olympus公司)；Olympus 倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；E spec BNA-311二氧化碳培養(yǎng)箱。1.3成骨細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)出生24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠，無(wú)菌條件下，剝離顱蓋骨，先用Hank液沖洗剝離組織數(shù)次，再用剪刀減碎后，用0.25%胰蛋白酶消化約1

10、0分鐘，棄去消化液，碎骨片再用胰蛋白酶消化數(shù)分鐘后，過(guò)濾，過(guò)濾液經(jīng)過(guò)離心后，取沉淀細(xì)胞加入血清終止消化，即是第一次的細(xì)胞。將上清液倒入尚未完全消化的碎骨片中，繼續(xù)消化后，如上所述重復(fù)3次，收集所有細(xì)胞，合并計(jì)數(shù)，按酶活性制定1.5×104細(xì)胞數(shù)/cm2的密度種于培養(yǎng)瓶中，對(duì)照組用DMEM作培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組在DMEM液中加入OGP，使OGP濃度分別為10-12M、10-10M、10-8M，上述細(xì)胞分置于375%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3天換液1次，約兩周傳代1次。第2次傳代后，分別于培養(yǎng)第3、7、10、14、21天收集細(xì)胞及培養(yǎng)液，測(cè)定其酶活力。1.4OGP制備OGP按Greenberg1

11、方法制備獲得，純度達(dá)99%，稱一定量OGP制備成貯存液，置冰箱冷凍室內(nèi)保存，用時(shí)解凍后，稀釋成不同濃度或?qū)⑵渲苯蛹尤隓MEM培養(yǎng)液中，用于細(xì)胞培養(yǎng)液。1.5細(xì)胞觀察應(yīng)用Olympus倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，生長(zhǎng)情況，并攝影記錄，培養(yǎng)成功再進(jìn)行測(cè)定。1.6酶活性測(cè)定酶活性測(cè)定采用蔡武城等2方法。1)堿性磷酸酶：以37，pH10.0，在10 mmol/L對(duì)-硝基酚磷酸酯(NPP)存在條件下，每分鐘催化生成1 mol對(duì)硝基酚的酶量為一個(gè)酶活性單位(U)2)酸性磷酸酶：以35，PH5.0，在1.2 mmol/L對(duì)-硝基酚磷酸酯(NPP)存在條件下，每分鐘催化生成1mol對(duì)硝基酚的酶量為一個(gè)酶活性

12、單位(U)1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以±S表示，統(tǒng)計(jì)方法采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果分別測(cè)定四組細(xì)胞培養(yǎng)第3、7、10、14和21天的細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)液中的堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活力。詳見附表及附。1培養(yǎng)14天四組細(xì)胞的堿性磷酸酶活性3討論早在1969年Amsel等3就發(fā)現(xiàn)去骨髓再生之前存在骨形成相，即骨髓腔中暫時(shí)性骨小梁形成。后來(lái)Bad4，5證實(shí)愈合的骨髓組織能產(chǎn)生促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子活性，并分離、純化得到一個(gè)由14個(gè)氨基酸組成的小肽，命名為成骨生長(zhǎng)肽。研究證實(shí)成骨生長(zhǎng)肽在體外能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，增殖和增加骨基質(zhì)礦化；在體內(nèi)能促進(jìn)造血，刺激造血基質(zhì)的微循環(huán)，促進(jìn)機(jī)體成骨作用，提高骨小梁密度。2

13、不同培養(yǎng)時(shí)間四組細(xì)胞內(nèi)的堿性磷酸酶活性表1酸性磷酸酶活性組別例數(shù)n時(shí)間(天數(shù))培養(yǎng)液中對(duì)照組670.14±0.046100.16±0.066140.16±0.05OGP10-8M實(shí)驗(yàn)組670.16±0.076100.20±0.056140.18±0.04注：結(jié)果顯示酸性磷酸酶活力實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)顯著差異。 本研究通過(guò)鼠胚顱蓋骨成骨細(xì)胞樣細(xì)胞觀察，證實(shí)培養(yǎng)液中加入OGP后的用藥組，不論OGP在培養(yǎng)液中的濃度如何，在培養(yǎng)早期都有堿性磷酸酶分泌，且堿性磷酸酶活力在細(xì)胞內(nèi)7天OGP10-12M濃度用藥組為1.30±0.19U/L；對(duì)

14、照組相同條件為0.62±0.19U/L；在細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)7天OGP10-8M濃度用藥組為0.82±0.16U/L；對(duì)照組相同條件為0.23±0.10U/L，均顯著地高于對(duì)照組(P<0.010.05)。鼠胚顱蓋骨分離細(xì)胞是由不同分化階段的成骨細(xì)胞樣細(xì)胞構(gòu)成，因此，在培養(yǎng)過(guò)程中將表現(xiàn)出不同分化階段的功能，所以作者用它作為培養(yǎng)模型進(jìn)行研究。堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞分化的指標(biāo)，在堿性環(huán)境中骨鈣化最活躍，成骨細(xì)胞釋放的堿性磷酸酶能使無(wú)機(jī)磷酸鹽水解，從而降低焦磷酸鹽濃度，有利于骨的礦化。因此，堿性磷酸酶可以作為反映骨形成的生化標(biāo)志物。本研究顯示，OGP能顯著增加成骨細(xì)胞樣細(xì)胞

15、及培養(yǎng)液的堿性磷酸酶活力(P<0.010.05)。Robinson等報(bào)道7OGP在10-9M濃度時(shí)能增加人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述說(shuō)法有相似之處，說(shuō)明OGP對(duì)人成骨細(xì)胞樣細(xì)胞也有上述結(jié)果。據(jù)培養(yǎng)日期分析(見)，實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)37天的成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的堿性磷酸酶活力開始升高，至10天左右活力有所下降，約21天細(xì)胞活性回升，這是細(xì)胞周期的影響。同時(shí)在研究中還發(fā)現(xiàn)不同OGP濃度對(duì)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞分泌堿性磷酸酶有調(diào)節(jié)作用。OGP在10-12M10-8M濃度范圍內(nèi)，表現(xiàn)為低濃度時(shí)分泌抑制，而高濃度時(shí)分泌上調(diào)(見)。這與Greenberg Z5等報(bào)道，OGP對(duì)細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶活性

16、表現(xiàn)為低濃度時(shí)抑制，達(dá)到某一臨界點(diǎn)后則為促進(jìn)的結(jié)論相符合。實(shí)驗(yàn)證明，OGP具有使成骨細(xì)胞樣細(xì)胞分泌堿性磷酸酶增加，與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.010.05)，且OGP的濃度對(duì)堿性磷酸酶活力有調(diào)節(jié)作用。酸性磷酸酶活性與破骨細(xì)胞的活性有關(guān)，因而成骨細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)液中的酸性磷酸酶水平反映了破骨細(xì)胞的活性和骨吸收的狀況。本研究中用OGP的實(shí)驗(yàn)組的酸性磷酸酶活性與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，說(shuō)明成骨生長(zhǎng)肽對(duì)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞酸性磷酸酶的分泌無(wú)影響。骨組織經(jīng)常處于舊骨被吸收，新骨再形成的骨重建過(guò)程。骨質(zhì)疏松癥是由于骨重建過(guò)程中骨吸收大于骨的形成8，實(shí)驗(yàn)表明成骨生長(zhǎng)肽具有促成骨作用。作者在電鏡觀察中發(fā)現(xiàn)，加OG

17、P培養(yǎng)的三組細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)比對(duì)照組豐富，是代謝旺盛的表現(xiàn)，同時(shí)光鏡觀察用藥組的細(xì)胞數(shù)目明顯多于對(duì)照組，且有細(xì)胞結(jié)節(jié)產(chǎn)生9，也證實(shí)了OGP具有促進(jìn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞分泌促成骨成份的作用。因此，OGP能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的成骨作用，促進(jìn)骨形成。它在治療骨折，骨質(zhì)疏松，骨植入和骨髓移植方面的作用，尚在研究起步階段，有待進(jìn)一步探討。本課題獲國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(編號(hào)39670724)作者單位：李群（上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院骨科上海市傷骨科研究所 200025）王智興（上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院骨科上海市傷骨科研究所 200025）朱雅萍（上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院骨科上海市傷骨科研究所 200

18、025）參考文獻(xiàn)1，Greenberg Z,Chorev M,Muhlrad A,et al.Structural and functional characterization of osteogenic growth peptide from human serum:identity with rat and mouse homologs.J Clin Endocrinol Metab,1995,80:2330.2，蔡武城，李碧羽，李玉民，等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程.上海：復(fù)旦大學(xué)出版社，1983，184-186.3，Amsel S,Maniatis A,Tavassoli M,et al.

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