串聯(lián)重復(fù)核定位信號的綠色熒光蛋白融合載體的構(gòu)建與原核表達

1、串聯(lián)重復(fù)核定位信號的綠色熒光蛋白融合載體的構(gòu)建與原核表達        【摘要】     目的： 構(gòu)建綠色熒光蛋白-串聯(lián)重復(fù)核定位信號融合蛋白的表達載體（HisEGFP3xNLS），并在原核細胞中進行表達與純化。方法： 采用PCR方法從原先克隆在pEGFPC1載體中的3xNLS與EGFP編碼序列擴增出來，使用常規(guī)酶切和連接方法將其重組至pET14b載體中，對陽性克隆進行酶切、PCR和測序鑒定。轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌株，用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達，并利用NiN

2、TA親和層析純化該融合蛋白。結(jié)果： 構(gòu)建的HisEGFP3xNLS融合蛋白表達載體是正確的，該載體可在大腸桿菌內(nèi)高效表達，用NiNTA純化獲得了相對分子質(zhì)量約36 kD的融合蛋白。結(jié)論： 成功構(gòu)建了HisEGFP3xNLS融合蛋白表達載體，并在原核細胞中獲得了高效表達和純化，為進一步研究NLS介導(dǎo)信號分子入核提供了實驗材料。     【關(guān)鍵詞】  核定位信號 載體蛋白質(zhì)類 基因表達 蛋白純化    Construction and Prokaryotic Expression of Green Fluor

3、escent Protein Fusion Vector of Tandem Nuclear Localization Signals    DENG Peng, CHEN Tengxiang, GONG Xiaowei    Department of Pathophysiology and Key Laboratory of Proteomics of Guangdong Province, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong, ChinaAbstrac

4、t Objective: To construct the expression vector of HisEGFP3xNLS fusion protein and obtain its expression and purification in E. coli. Methods： 3xNLS and EGFP sequence was amplified by PCR from pEGFPC13xNLS vector and cloned into pET14b vector following the routine procedures. After identification by

5、 enzyme digestion, PCR and sequencing, the positive clones were transformed into BL21 (DE3) competent cells, and the expression of HisEGFP3xNLS fusion protein was induced with IPTG and further purified by NiNTA affinity chromatography. Results: The constructed HisEGFP3xNLS fusion protein vector high

6、ly expressed in E. coli. With NiNTA affinity chromatography, a purified His fusion protein with relative molecular mass of approximately 36 kD was obtained. Conclusion: The expression vector of HisEGFP3xNLS fusion protein is constructed, expressed and purified under nondenaturing conditions, which m

7、ay significantly facilitate future study of the mechanism by which NLS mediate the nuclear translocation of certain signal molecules.Key words nuclear localization signal; carrier proteins; gene expression; protein purification    信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的時空特征，即信號蛋白的亞細胞定位（subcellular localization）和激活后移位（

8、translocation）已成為目前細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的熱點領(lǐng)域1，2，信號分子的特異性亞細胞定位有助于細胞高效經(jīng)濟地完成各種正常生理功能和病理反應(yīng)。在刺激誘導(dǎo)的多種不同信號分子的移位入核過程中，核定位信號（nuclear localization signal, NLS）都扮演著重要的角色24，但目前NLS與核孔復(fù)合體（nuclear pore complex, NPC）的相互作用介導(dǎo)信號分子入核的具體機制仍未完全闡明。本實驗構(gòu)建了與增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）融合的3個串聯(lián)重復(fù)的NLS融合蛋白原核表達載體，為研究NL

9、S介導(dǎo)信號分子入核的機制提供了一個重要的工具。1  材料和方法1.1  質(zhì)粒 帶有三個串聯(lián)重復(fù)的NLS（3xNLS）增強型綠色熒光蛋白載體pEGFPC1由挪威Troms大學Seternes教授饋贈，該質(zhì)粒中3xNLS的序列為aggaagaggaagctgctgaggaagaggaagctgctgaggaagaggaagctgctg，利用Hind III和Pst I克隆在pEGFPC1中。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌株DH5，提取質(zhì)粒DNA，用DNA/RNA定量儀測定DNA濃度，置-20 保存?zhèn)溆?。pET14b質(zhì)粒和大腸桿菌株BL21(DE3)由本室保存。1.2 

10、主要試劑 QIAprep Spin Miniprep Kit和NiNTA親和樹脂是QIAGEN公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶(Nde I、BamH I)、T4 DNA連接酶和Pyrobest高保真DNA聚合酶購自TaKaRa公司，100 bp和 1 kb DNA ladder分別是Toyobo公司和Stratagene公司產(chǎn)品，異丙基-D-硫代半乳糖（isopropylDthiogalactoside, IPTG）購自SigmaAldrich公司，引物由英駿公司合成。1.3  HisEGFP3xNLS融合載體的構(gòu)建 見圖1。從pEGFPC13xNLS載體中擴增EGFP和3

11、xNLS所用的上游引物序列為5tacatatgatggtgagcaagggcgaggagct3，其中下劃線部分是EGFP基因編碼序列的第123位堿基；下游引物序列為5taggatccttacgggcccgcggtaccgtcgactgca3，其中下劃線部分是添加的終止密碼子及pEGFPC1載體上BamH I位點前的25位堿基的反向互補序列。用Pyrobest高保真聚合酶進行PCR反應(yīng)（95 30 s, 55 30 s,72 60 s，共30個循環(huán)），擴增片段大小為848 bp。將PCR產(chǎn)物用Nde I和BamH I酶切，隨后與Nde I和BamH I雙酶切并電泳切膠回收的pET14b連接，將連

12、接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌株DH5。挑取單菌落接種于Amp+的LB培養(yǎng)基中，37 振搖過夜。取5 ml菌液用QIAprep Spin Miniprep Kit小量提取質(zhì)粒后，用Nde I和BamH I酶切鑒定。另外使用上述引物對重組體進行PCR鑒定。酶切及PCR鑒定產(chǎn)物用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠圖像分析儀上成像。重組體最終經(jīng)測序鑒定無誤后，置-20 保存?zhèn)溆谩?.4  HisEGFP3xNLS融合蛋白的原核表達及純化  將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌株BL21(DE3)。挑取單菌落，置于2 ml LB(Amp+)培養(yǎng)基中，37 振搖培養(yǎng)至D600約為0.6時，加入終濃度

13、為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)振搖3 h。利用12 % SDSPAGE來鑒定表達融合蛋白的菌落。對有HisEGFP3xNLS融合蛋白表達的菌落進行大量（100 ml）菌液擴增誘導(dǎo)，6 000×g、4 離心10 min；將細菌沉淀重懸于4 ml結(jié)合緩沖液（300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L NaH2PO4, 10 mmol/L咪唑, 0.1% TritonX 100, pH8.0）中，超聲破碎，15 000×g, 4 離心15 min。將上清加入100 l NiNTA親和樹脂中4 孵育1 h，然后用1 ml的洗滌緩沖液（300 mmol/L Na

14、Cl, 50 mmol/L NaH2PO4, 20 mmol/L咪唑, pH8.0）洗NiNTA親和樹脂3次；最后用洗脫緩沖液（300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L NaH2PO4, 250 mmol/L咪唑, pH8.0）洗脫蛋白后，12% SDSPAGE鑒定結(jié)果。    2  結(jié)果2.1  HisEGFP3xNLS融合載體的鑒定 電泳結(jié)果表明有約0.85 kb和4.7 kb兩個條帶，符合插入片段的大?。▓D2A）。用特異性引物進行PCR反應(yīng)擴增出約0.85 kb的條帶，也符合預(yù)計結(jié)果（圖2B）。測序結(jié)果（用T7 pr

15、omoter primer和T7 terminator primer雙向測通）證實插入到pET14b載體中的目的片段是正確的。2.2  HisEGFP3xNLS融合蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達和純化 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，細菌裂解液在約36 kD處形成一條濃密的蛋白條帶，與預(yù)期的HisEGFP3xNLS融合蛋白大小一致。利用NiNTA親和層析法對細菌裂解液進行純化后，在約36 kD處得到一條唯一的蛋白條帶（圖3）。3  討論    許多信號通路激活的最終結(jié)果都可引起細胞的基因表達發(fā)生改變，這通常需要在信號通路被激活時，該級聯(lián)中的某種蛋白從細

16、胞質(zhì)移位到細胞核中，通過作用于其下游底物引起特異性的基因轉(zhuǎn)錄。真核細胞可以通過多種機制迅速誘導(dǎo)蛋白質(zhì)從胞質(zhì)移位入核5。影響蛋白質(zhì)在胞質(zhì)和胞核中分布主要包括兩個因素，即與核轉(zhuǎn)運機器或錨定蛋白的相互作用6，7。對于某種信號蛋白而言，如果其分布于胞質(zhì)中，且核輸入速率低于核輸出速率，那么當其與輸入受體-輸入素的結(jié)合增加，與輸出受體-輸出素的結(jié)合降低，或兩者同時存在時將迅速移位入核8。    蛋白進出細胞核都必須通過NPC，小于50 kD的分子能通過核孔自由擴散進出核，而大一些的分子則需要一個NLS4。NLS一般具有如下特征：（1）長度一般小于20個氨基酸；（2）在蛋白入核

17、內(nèi)后不被移除；（3）通常富含帶正電的（堿性）氨基酸。除此之外，NLS之間不存在一致的序列9。核輸入過程可分為三個步驟。首先，位于胞質(zhì)中的貨物（需要移位入核的蛋白質(zhì)，具有NLS或與具有NLS的蛋白質(zhì)結(jié)合）與輸入素結(jié)合，形成的貨物-輸入素復(fù)合體，隨后被靶向到NPC上。移位過程需要小分子量GTP酶Ran、GTP的參與和生理溫度，目前該過程的具體機制尚未闡明。入核后，貨物-輸入素復(fù)合體在RanGTP與輸入素結(jié)合后解離。貨物在核中被卸下，而輸入素返回到胞質(zhì)中進行下一輪的轉(zhuǎn)運。因而，NLS對于蛋白質(zhì)移位入核具有重要作用4。研究表明，p38調(diào)節(jié)/激活蛋白激酶/MAPK激活蛋白激酶5移位入核依賴于其C末端的NLS10。    Seternes等利用三個串聯(lián)重復(fù)NLS序列與EGFP融合的真核表達載體證實了p38通過與其下游底物MK5的結(jié)合和對其的激活來參與其核-胞質(zhì)分布的調(diào)控11。為了研究NLS在介導(dǎo)蛋白質(zhì)入核中的確切機制（例如通過某些抑制劑的使用）